Pagrindinis optinio mikroskopo stebėjimo metodas yra fluorescencinis stebėjimas
Fluorescencija reiškia procesą, kurio metu fluorescencinė medžiaga skleidžia ilgesnės bangos šviesą beveik vienu metu, kai ji apšvitinama tam tikro bangos ilgio šviesa (1 pav.). Kai tam tikro bangos ilgio (sužadinimo bangos ilgio) šviesa patenka į molekulę, pavyzdžiui, esančią fluorofore, fotono energiją sugeria molekulės elektronai. Toliau elektronai pereina iš pagrindinės būsenos (S0) į aukštesnį energijos lygį – sužadinimo būseną (S1'). Šis procesas vadinamas sužadinimu①. Elektronas išbūna sužadintas 10-9–10-8 sekundes, per kurias elektronas praranda dalį energijos②. Elektronams išeinant iš sužadintos būsenos (S1) ir grįžtant į pagrindinę būseną③, išsiskiria likusi energija, sugerta sužadinimo proceso metu.
Fluorescencinės molekulės buvimo laikas sužadintoje būsenoje yra fluorescencijos trukmė, kuri paprastai yra nanosekundės lygyje ir yra būdinga pačios fluorescencinės molekulės savybė. Fluorescencinis viso gyvenimo trukmės vaizdavimas (FLIM), kuriame naudojama fluorescencinio gyvenimo trukmės vaizdo technologija, vadinama fluorescenciniu viso gyvenimo vaizdavimu (FLIM). Be fluorescencinio intensyvumo vaizdavimo, galima gauti išsamesnius funkcinius ir tikslesnius matavimus, kad būtų galima gauti molekulinę konformaciją, tarpmolekulines sąveikas ir molekulių mikroaplinką. Informacija, kurią sunku gauti naudojant įprastą optinį vaizdą.
Kita svarbi fluorescencijos savybė yra Stokso poslinkis, bangos ilgių skirtumas tarp sužadinimo ir emisijos smailių (2 pav.). Paprastai emisijos bangos ilgis yra ilgesnis nei sužadinimo bangos ilgis. Taip yra todėl, kad elektronai praras dalį savo energijos per atsipalaidavimo procesą, kai fluorescencinė medžiaga bus sužadinta ir prieš išskirdami fotonus. Fluorescencines medžiagas su didesniais Stokso poslinkiais lengviau stebėti fluorescenciniu mikroskopu.
Fluorescencinė mikroskopija ir fluorescencinio filtro kubeliai
Fluorescencinis mikroskopas yra optinis mikroskopas, kuris naudoja fluorescencines savybes stebėjimui ir vaizdavimui, ir yra plačiai naudojamas įvairiose srityse, tokiose kaip ląstelių biologija, neurobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija ir genetika. Fluorescencinis vaizdavimas turi didelio jautrumo ir didelio specifiškumo privalumus ir yra labai tinkamas stebėti specifinių baltymų ir organelių pasiskirstymą audiniuose ir ląstelėse, tirti kolokalizaciją ir sąveiką, sekti gyvybės dinaminius procesus, tokius kaip jonų koncentracijos pokyčiai. ir kt.
Dauguma ląstelėse esančių molekulių nefluorescuoja, o norint jas pamatyti, jos turi būti pažymėtos fluorescenciniu būdu. Yra daug fluorescencinio ženklinimo metodų, tokių kaip tiesioginis žymėjimas (pvz., naudojant DAPI žymėti DNR) arba imuninis dažymas naudojant antikūnų antigenus surišančias savybes arba naudojant fluorescencinius baltymus (pvz., GFP, žalią fluorescencinį baltymą) tiksliniams baltymams pažymėti. , ir grįžtamasis įrišimas. Sintetiniai dažikliai (pvz., Fura{1}}) ir pan.
Šiuo metu fluorescencinis mikroskopas tapo standartine įvairių laboratorijų ir vaizdo platformų vaizdo gavimo įranga ir yra geras pagalbininkas kasdieniams eksperimentams. Fluorescenciniai mikroskopai daugiausia skirstomi į tris kategorijas: vertikalieji fluorescenciniai mikroskopai (tinkami pjaustyti), atvirkštiniai fluorescenciniai mikroskopai (tinka gyvoms ląstelėms, atsižvelgiant į pjaustymą), fluorescenciniai stereoskopai (tinkami didesniems egzemplioriams, pvz., augalams, zebražuvėms (suaugusiems / embrionams). ), medaka, pelės/žiurkės organai ir kt.).
Fluorescencinio filtro blokas yra pagrindinis mikroskopinio fluorescencinio vaizdo komponentas. Jį sudaro trys dalys: sužadinimo filtras, emisijos filtras ir dichroinio pluošto skirstytuvas. Jis sumontuotas filtro ratuke. Pavyzdžiui, „Leica DMi8“ yra 6-padėties filtro ratukas (3 pav.). Skirtingų mikroskopo ratukų padėčių skaičius skirsis, o kai kuriuose mikroskopuose naudojami filtrų blokų stikleliai.
Fluorescenciniame vaizdavime filtro blokas atlieka svarbų vaidmenį: sužadinimo filtras parenka sužadinimo šviesą, kad sužadintų mėginį, ir blokuoja kitų bangų ilgių šviesą; šviesa, einanti per sužadinimo filtrą, praeina per dichroinį veidrodį (jo funkcija yra atspindėti sužadinimo šviesą ir perduoti fluorescenciją), po atspindžio ji sufokusuojama objektyvo, apšvitina mėginį ir sužadina atitinkamą fluorescenciją, t. , skleidžiama šviesa. Skleidžiamą šviesą surenka objektyvo lęšis, praeina per dichroinį pluošto skirstytuvą ir pasiekia emisijos filtrą. Kaip parodyta 4 paveiksle: sužadinimo bangos ilgis yra 450-490nm, dichroinis veidrodis atspindi trumpesnę nei 510 nm šviesą, praleidžia ilgesnę nei 510 nm šviesą, o skleidžiamos šviesos priėmimo diapazonas yra 520-560 nm.
