Pagrindinis optinio mikroskopo stebėjimo metodas yra fluorescencinis stebėjimas
Fluorescencijos reiškinys
Fluorescencija reiškia procesą, kai fluorescencinė medžiaga skleidžia ilgesnės bangos šviesą beveik vienu metu, kai yra apšvitinta tam tikro bangos ilgio šviesa (1 pav.). Kai tam tikro bangos ilgio (sužadinimo bangos ilgio) šviesa atsitrenkia į molekulę (pvz., fluoroforo molekulę), fotono energiją sugeria molekulės elektronai. Toliau elektronai pereina iš pagrindinės būsenos (S0) į aukštesnį energijos lygį – sužadinimo būseną (S1'). Šis procesas vadinamas sužadinimu①. Elektronas išbūna sužadintas 10-9–10-8 sekundes, per kurias elektronas praranda dalį energijos ②. Išeinant iš sužadinimo būsenos (S1) ir grįžtant į pagrindinę būseną ③, bus išleista likusi energija, sugerta sužadinimo proceso metu.
Fluorescencinės molekulės buvimo laikas sužadintoje būsenoje yra fluorescencijos trukmė, paprastai nanosekundėmis, kuri yra būdinga pačios fluorescencinės molekulės savybė. Vaizdo gavimo technologija, naudojant fluorescencijos gyvavimo trukmę, vadinama Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), kuri gali atlikti išsamesnius funkcinius ir tikslesnius matavimus, be fluorescencijos intensyvumo vaizdavimo, siekiant gauti molekulinę konformaciją, tarpmolekulines sąveikas ir molekulinę mikroaplinką. informaciją, kurią sunku gauti naudojant įprastą optinį vaizdą.
Kita svarbi fluorescencijos savybė yra Stokso poslinkis, bangos ilgio skirtumas tarp sužadinimo ir emisijos smailių (2 pav.). Paprastai spinduliuotės šviesos bangos ilgis yra ilgesnis už sužadinimo šviesos bangos ilgį. Taip yra todėl, kad fluorescencinei medžiagai sužadinus ir prieš fotonui išsilaisvinus, atsipalaidavimo proceso metu elektronai praras dalį energijos. Fluorescencines medžiagas su didesniais Stokso poslinkiais lengviau stebėti fluorescenciniu mikroskopu.
Fluorescenciniai mikroskopai ir fluorescencinių filtrų blokai
Fluorescencinė mikroskopija yra optinis mikroskopas, kuris naudoja fluorescencines savybes stebėti ir vaizduoti, ir plačiai naudojamas ląstelių biologijoje, neurobiologijoje, botanikoje, mikrobiologijoje, patologijoje, genetikoje ir kitose srityse. Fluorescencinis vaizdavimas turi didelio jautrumo ir didelio specifiškumo privalumus ir yra labai tinkamas specifinių baltymų, organelių ir kt. pasiskirstymui audiniuose ir ląstelėse stebėti, bendrosios lokalizacijos ir sąveikos tyrimui bei gyvybės dinamikos sekimui. procesai, tokie kaip jonų koncentracijos pokyčiai.
Dauguma ląstelėse esančių molekulių nefluorescuoja, o norint jas pamatyti, jos turi būti paženklintos fluorescenciniu būdu. Yra daug fluorescencinio žymėjimo metodų, kuriuos galima ženklinti tiesiogiai (pavyzdžiui, naudojant DAPI žymėti DNR), arba imuninį dažymą naudojant antikūnų antigenus rišančias savybes, arba tikslinį baltymą galima pažymėti fluorescenciniais baltymais (pvz., GFP, žaliais). fluorescencinis baltymas) arba grįžtamasis prisijungimas. sintetiniai dažai (pvz., Fura{1}}) ir kt.
Šiuo metu fluorescencinis mikroskopas tapo standartine įvairių laboratorijų ir vaizdo platformų vaizdo gavimo įranga ir yra geras pagalbininkas kasdieniams eksperimentams. Fluorescenciniai mikroskopai daugiausia skirstomi į tris kategorijas: vertikalieji fluorescenciniai mikroskopai (tinkami pjūviams), atvirkštiniai fluorescenciniai mikroskopai (tinka gyvoms ląstelėms, atsižvelgiant į pjūvius), fluorescenciniai stereoskopiniai mikroskopai (tinkami didesniems egzemplioriams, pvz., augalams, zebražuvėms (suaugusiems/suaugusiems). embrionas), medaka, pelės / žiurkės organai ir kt.).
Fluorescencinio filtro blokas yra pagrindinis fluorescencinio vaizdo vaizdavimo mikroskopuose komponentas. Jį sudaro sužadinimo filtras, emisijos filtras ir dichroinio pluošto skirstytuvas. Jis įmontuotas į filtro ratuką, pvz., „Leica DMi8“ su 6-padėties filtro ratuku (3 pav.). ). Skirtingi mikroskopai turi skirtingas ratų padėtis, o kai kuriuose mikroskopuose naudojami filtrų stikleliai.
Fluorescenciniame vaizdavime filtro blokas atlieka svarbų vaidmenį: sužadinimo filtras parenka sužadinimo šviesą, kad sužadintų mėginį, ir blokuoja kitus šviesos bangos ilgius; šviesa, einanti per sužadinimo filtrą, praeina per dichroinį pluošto skirstytuvą (jo vaidmuo yra atspindėti sužadinimo šviesą ir perduoti fluorescenciją), po atspindžio ji sufokusuojama objektyvo, apšvitinama į mėginį ir atitinkama fluorescencija sužadinama iki skleisti šviesą. Skleidžiamą šviesą surenka objektyvo lęšis, praeina per dichroinį pluošto skirstytuvą ir pasiekia emisijos filtrą. Kaip parodyta 4 paveiksle: sužadinimo bangos ilgis yra 450-490nm, dichroinio pluošto skirstytuvas atspindi trumpesnę nei 510 nm šviesą, praleidžia ilgesnę nei 510 nm šviesą, o spinduliuotės šviesos priėmimo diapazonas yra 520-560 nm.
Fluorescenciniai filtrai, dažniausiai naudojami fluorescenciniuose mikroskopuose, gali būti suskirstyti į du tipus: ilgo pralaidumo (trumpai – LP) ir juostos pralaidumo (trumpai – BP). Juostos pralaidumas paprastai nustatomas pagal centrinį bangos ilgį ir intervalo plotį, pvz., 480/40, o tai reiškia, kad šviesa iš 460-500nm gali būti praleidžiama. Ilgo pralaidumo filtrai, tokie kaip 515 LP, praleidžia šviesą, kurios bangos ilgis yra didesnis nei 515 nm (5 pav.).
Fluorescencinės medžiagos turi būdingą sužadinimo (absorbcijos) kreivę ir emisijos kreivę, sužadinimo smailė yra idealus sužadinimo bangos ilgis (didelis sužadinimo efektyvumas, kuris gali sumažinti sužadinimo šviesos energiją, apsaugoti ląsteles ir dažus), o emisijos kreivė yra emisijos fluorescencijos bangos ilgis. diapazonas. Todėl eksperimente sužadinimui parinksime kuo artimesnį sužadinimo smailės bangos ilgį, o priėmimo diapazonas turi apimti emisijos smailę. Pavyzdžiui, Alexa Fluor 488 sužadinimo smailė yra 500 nm, o fluorescenciniame mikroskope galima pasirinkti 480/40 sužadinimo filtrą.
Išsamią informaciją apie filtrų kubus galima peržiūrėti mikroskopo vaizdo programinėje įrangoje. Fluorescenciniam vaizdavimui labai svarbu suprasti dažus ir rasti filtrą, kuris geriausiai atitinka jūsų mėginį. Fluorescuojančių dažų ir fluorescencinių baltymų spektrinė informacija paprastai nurodoma instrukcijose, ją taip pat galima rasti internete.
Be fluorescencinių zondų sužadinimo ir emisijos bangos ilgių, parenkant filtrų blokus taip pat reikia atsižvelgti į tai, ar yra nespecifinio sužadinimo ir ar yra kryžminė spalva įvairiaspalviams ženklintiems mėginiams. Be to, būtina atsižvelgti į naudojamą fluorescencinės šviesos šaltinį. Šiuo metu dažniausiai naudojami fluorescenciniai šviesos šaltiniai yra gyvsidabrio lempos, metalų halogenų lempos ir LED šviesos šaltiniai, kurie pastaraisiais metais sparčiai vystėsi. Liuminescencinio šviesos šaltinio spektras yra nenutrūkstamas arba nenutrūkstamas, o energija skirtingose bangos ilgio juostose skirsis. LED šviesos šaltinis pamažu tampa pagrindiniu fluorescencinio mikroskopo šviesos šaltiniu dėl santykinai siauros spektrinės juostos, stabilesnės energijos išvesties, ilgo tarnavimo laiko, saugesnės ir aplinkos apsaugos bei daugybės kitų privalumų.
Be įmontuoto mikroskopo filtrų bloko, yra ir išorinis greitas ratas (7 pav.). Filtro, esančio šalia išorinio greitojo „Leica“ rato, konversijos greitis yra 27 ms, todėl galima atlikti didelės spartos kelių spalvų eksperimentus, tokius kaip FRET ir Fura2 santykio kalcio vaizdavimas. (8 pav.) ir kt.
Įvairūs fluorescencinės mikroskopijos vaizdavimo metodai
Siekiant patenkinti skirtingus fluorescencinio vaizdo poreikius, be fluorescencinių mikroskopų buvo sukurti įvairūs fluorescencinės mikroskopijos vaizdo gavimo sprendimai:
Plataus lauko didelės raiškos vaizdo sistemos, tokios kaip Leica THUNDER Imager, naudoja naujovišką Leica Clearing technologiją, kad efektyviai pašalintų ne židinio plokštumos trukdžių signalus vaizdavimo metu, pateikiant aiškius vaizdus ir didelės spartos vaizdo privalumus;
Konfokalinis lazerinis skenuojantis mikroskopas naudoja skylutes, kad pašalintų ne židinio plokštumos trukdžius, realizuojamas optinis pjūvis ir gaunami didelės raiškos vaizdai bei trimačiai vaizdai;
Itin didelės skiriamosios gebos mikroskopai ir nanomikroskopai, pralaužantys difrakcijos ribą, gali stebėti smulkias struktūras, mažesnes nei 200 nm;
Daugiafotonų vaizdo gavimo sistema, naudojanti daugiafotonų sužadinimo principą storų audinių ir gilių in vivo vaizdavimui;
Šviesos lakštų vaizdo gavimo technologija, pasižyminti didele laiko ir erdvine skiriamąja geba, dideliu vaizdų gavimo greičiu, didele skiriamąja geba, mažu fototoksiškumu, ypač tinkama vystymosi tyrimams ir dinaminiam stebėjimui in vivo;
Fluorescencinis viso gyvenimo vaizdavimas (FLIM), kuriam įtakos neturi tokie veiksniai kaip fluorescencinės medžiagos koncentracija, fotobalinimas, sužadinimo šviesos intensyvumas ir kt., gali atlikti išsamesnius funkcinius ir tikslesnius matavimus;
Fluorescencinė koreliacinė spektroskopija (FCS) ir fluorescencinė kryžminė koreliacinė spektroskopija (FCCS) matuoja fluorescencinių molekulių molekulinį skaičių ir difuzijos koeficientą, taip analizuodami molekulių koncentraciją, molekulių dydį, klampumą, molekulių judėjimą, molekulių surišimą / disociaciją ir molekulines optines savybes;
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRF), pasižyminti itin aukšta z ašies skiriamąja geba, idealiai tinka tiriant ląstelių membranų paviršių molekulinę struktūrą ir dinamiką.
