Skirtumas tarp (dviejų fotonų, konfokalinių) fluorescencinio mikroskopo ir įprasto mikroskopo
Pagrindinis dviejų fotonų sužadinimo principas yra tas, kad esant dideliam fotono tankiui, fluorescencinės molekulės gali tuo pačiu metu absorbuoti du ilgo bangos ilgio fotonus ir po trumpo vadinamosios sužadintos būsenos gyvenimo trukmės fotono skleisti trumpesnį bangos ilgio fotoną; Poveikis yra tas pats, kaip naudoti fotoną su puse ilgo bangos ilgio bangos ilgio, kad sujaudintų fluorescencines molekules. Dviejų fotonų sužadinimui reikalingas didelis fotono tankis, o norint išvengti sugadintų ląstelių, dviejų fotonų mikroskopija naudoja didelės energijos režimo fiksuotus impulsų lazerius. Šio lazerio skleidžiamas lazeris turi didelę didžiausią energiją ir mažą vidutinę energiją, kurio impulsų plotis yra tik 100 femtosekundžių, o dažnis - nuo 80 iki 100 megahercų. Kai naudojama aukšta skaitmeninė diafragmos objektyvu, kad būtų galima sufokusuoti impulsinio lazerio fotonus, fotono tankis objektyvo objektyvo židinio taške yra aukščiausias, o dviejų fotonų sužadinimas įvyksta tik objektyvaus objektyvo židinio taške. Todėl dviejų fotonų mikroskopui nereikia konfokalinės skylės, o tai pagerina fluorescencijos aptikimo efektyvumą.
Apskritai fluorescenciniai reiškiniai, dėl mažo sužadinimo šviesos fotono tankio, fluorescencinė molekulė gali absorbuoti tik vieną fotoną vienu metu, o paskui išstumti kitą fluorescencinį fotoną per radiacijos perėjimą, kuris yra žinomas kaip pavienių fotonų fluorescencija. Fluorescencinio sužadinimo procesams, naudojant lazerius kaip šviesos šaltinius, gali atsirasti dviejų fotonų ar net daugiafotono fluorescencijos reiškiniai. Tokiu atveju naudojamas sužadinimo šviesos šaltinis turi didelį intensyvumą ir fotonų tankį, kuris atitinka reikalavimą, kad fluorescencinės molekulės būtų absorbuojamos dviem fotonais vienu metu. Naudojant bendrą lazerį kaip sužadinimo šviesos šaltinį, fotono tankis vis dar nepakanka dviejų fotonų absorbcijos reiškiniui gaminti. Paprastai naudojami femtosekundės impulsų lazeriai, kai megavatų lygis pasiekia momentinę galią. Todėl dviejų fotonų fluorescencijos bangos ilgis yra trumpesnis nei sužadinimo šviesos, lygiavertis poveikiui, kurį sukelia pusės sužadinimo bangos ilgio sužadinimas.
Žinios, susijusios su konfokaline fluorescencine mikroskopija
Pagrindinis konfokalinės fluorescencinės mikroskopijos principas yra naudoti taškinį šviesos šaltinį, kad būtų galima švitinti bandinį, sudarant tiksliai apibrėžtą mažą šviesos tašką židinio plokštumoje. Iš šios vietos skleidžiama fluorescencija po švitinimo yra surinktas objektyvu ir išsiųstas atgal palei pradinį švitinimo kelią į pluošto skirstytuvą, kurį sudaro dichroinis veidrodis. Spektrometras siunčia fluorescenciją tiesiai į detektorių. Priešais šviesos šaltinį ir detektorių yra smeigtukas, atitinkamai vadinamas apšvietimo smeigtuku ir aptikimo pinhole. Dviejų geometriniai matmenys yra nuoseklūs, apytiksliai 100-200 nm; Palyginti su židinio plokštumos šviesos tašku, abu yra konjuguoti, tai reiškia, kad šviesos taškas praeina per daugybę objektyvų ir galiausiai gali sutelkti dėmesį tiek į apšvietimo smaigalį, tiek aptikimo smaigalį vienu metu. Tokiu būdu židinio plokštumos šviesa gali suartėti aptikimo angos diapazone, o išsibarstę šviesa iš viršaus arba žemiau židinio plokštumos yra užblokuota už aptikimo angos ir jo negalima atvaizduoti. Nuskaitydamas mėginio tašką po tašku lazeriu, fotomultiplier vamzdis, aptikus smaigalį, taip pat gauna atitinkamą šviesos taškinio taško konfokalinį vaizdą, paverčiant jį skaitmeniniu signalu ir perduoda į kompiuterį, o galiausiai sujungia jį į aiškų konfokalinį visos židinio plokštumos vaizdą ekrane.
