Mėginio paruošimo fluorescencinei mikroskopijai reikalavimai
Mėginio paruošimo fluorescencinei mikroskopijai reikalavimai
(1) Stiklinė stiklinė
Stumdomo stiklo storis turi būti nuo 0.8-L2 mm. Viena vertus, per storas stiklelis sugers daugiau šviesos ir, kita vertus, negalės sufokusuoti sužadinimo šviesos į bandinį. Skaidrės turi būti lygios, vienodo storio ir be akivaizdžios autofluorescencijos. Kartais naudojamos kvarcinės skaidrės.
(2) Dangtis stiklas
Dengiamojo stiklo storis yra apie 0,17 mm, lygus. Siekiant sustiprinti sužadinimo šviesą, taip pat gali būti naudojamas interferencinis dengiantis stiklas, kuris yra specialus dengiantis stiklas, padengtas keliais sluoksniais medžiagų (pvz., magnio fluorido), kurios turi skirtingą trukdžių poveikį skirtingo bangos ilgio šviesai, todėl gali būti fluorescencija lygi. Praleidžiama sužadinimo šviesa, o sužadinimo šviesa atsispindi, o ši atspindėta sužadinimo šviesa gali sužadinti bandinį.
(3) Pavyzdys
Audinių griežinėliai ar kiti mėginiai neturi būti per stori. Jei storis per storas, didžioji dalis sužadinimo šviesos bus sunaudota apatinėje bandinio dalyje, o viršutinė dalis, kurią tiesiogiai stebi objektyvo lęšis, negali būti visiškai sužadinta. Be to, fluorescencija, kurią sukelia persidengiančios ląstelės arba priemaišos, foninis nespecifinis dažymas, turi įtakos sprendimui.
(4) veidrodinė alyva
Paprastai, stebint mėginius tamsaus lauko fluorescenciniais mikroskopais ir imersiniais alyvos mikroskopais, reikia naudoti imersinę alyvą. Geriausia naudoti specialią nefluorescencinę imersinę alyvą. Vietoj jų taip pat galima naudoti gliceriną, taip pat skystą parafiną, tačiau lūžio rodiklis yra žemas, o tai turi nedidelę įtaką vaizdo kokybei.
Fluorescencinės mikroskopijos šviesos kubo supratimas
Fluorescencija yra šviesa, kurią naudojant elektronai sugeria šviesos energiją iš mažos energijos būsenos į didelės energijos būseną, o tada išleidžia šviesą, kai ji grįžta į mažos energijos būseną. Tai ne temperatūros spinduliuojama šviesa – liuminescencija. Tai yra: medžiaga sugeria trumpųjų bangų šviesą, pereina į sužadinimo būseną ir skleidžia ilgųjų bangų šviesą.
Nesvarbu, ar tai yra medžiagos autofluorescencija, fluorescenciniai dažai ar fluorescencinis baltymas, išreikštas sintezės būdu, jis turi būti sužadintas tam tikro šviesos bangos ilgio (Sužadinimas). Po to, kai elektronai migruoja ir praranda energiją, jie skleidžia tam tikro ilgo bangos ilgio šviesą (emisiją). , kurį gali surinkti aptikimo sistema, kad būtų galima nustatyti specifinę fluorescenciją.
Kas yra fluorescencinis šviesos kubas?
Fluorescencinio mikroskopo stebėjimo ir vaizdavimo metu specifinio bangos ilgio sužadinimo šviesą ir atitinkamą ilgos bangos spinduliuotės šviesą suteikia fluorescencinis šviesos kubas, kad fluorescencijos signalą būtų galima surinkti plika akimi, ekranu ar fotoaparatu. Todėl fluorescencinis šviesos kubas nustato, ką galima aptikti Pagrindinis fluorescencinio signalo įtaisas, jo charakteristikos apima EX: sužadinimo bangos ilgio filtro parametrus, EM: emisijos bangos ilgio filtro parametrus ir DM: dichotominio veidrodžio parametrus. Kaip pavyzdį paimkite „Revolve“ integruoto fluorescencinio mikroskopo DAPI šviesos kubą, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425 nm šviesa gali būti perduodama į EM; EM emisijos filtrai naudojami fluoroforo skleidžiamai fluorescencijai atskirti nuo kitų foninių optinių elementų šviesai atskirti. Emisijos filtrai perduoda šviesą fluorescencijos bangos ilgiu per dichroinį veidrodį, tuo pačiu blokuodami visą kitą šviesą, kuri nuteka iš sužadinimo šviesos šaltinio (atspindinčią iš mėginio ar optikos). Skleidžiamos šviesos bangos ilgis yra didesnis nei EM, kurį reikia stebėti, ty į aptikimo sistemą patenka tik 450±25 nm diapazono šviesa. Tinkamas EX, EM filtrų ir DM dichotomijų pasirinkimas gali padėti mokslininkams pasiekti didesnį signalo ir triukšmo santykį (S/N).
