Biologinių mikroskopų optinės savybės
Optinis mikroskopo veikimas nustatomas pagal šiuos aštuonis pagrindinius optinius parametrus (arba parametrus):
(1) Skaitmeninė diafragma
Skaitmeninė diafragma taip pat vadinama veidrodiniu santykiu. Tai reiškia terpės tarp stebimo objekto ir lęšio lūžio rodiklio n sandaugą ir pusės objektyvo lęšio kampo sinuso vertę. Norėdami atstovauti, naudokite NA arba A. NA=nsin( /2)
Vadinamasis veidrodžio burnos kampas reiškia kampą tarp stebimo taško kraštinių spindulių, patenkančių į priekinį objektyvo lęšį.
Skaitmeninė diafragma yra svarbus objektyvo lęšio ir kondensatoriaus lęšio parametras, glaudžiai susijęs su kitais mikroskopo optiniais parametrais. Paprastai tikimasi, kad kuo didesnis, tuo geriau. Iš formulės matyti, kad skaitmeninę diafragmą galima padidinti dviem būdais: vienas – padidinti veidrodžio burnos kampą, o kitas – padidinti lūžio rodiklį tarp objektyvo lęšio ir bandinio.
Pritaikius ankstesnį metodą, pavyzdį ir objektą galima laikyti kuo arčiau. Bet nesvarbu, kaip arti, visada yra mažesnė nei 180 laipsnių. Taigi sin( /2) taip pat yra mažesnis už 1. Oro lūžio rodiklis yra n=1. Todėl sauso objektyvo objektyvo skaitmeninė diafragma nsin( /2) visada yra mažesnė nei 1, paprastai tarp 0,04 ir 0,95.
Taikant pastarąjį metodą, tarp objektyvo lęšio ir bandinio galima pridėti terpę su didesniu lūžio rodikliu. Pavyzdžiui, kedro aliejaus lūžio rodiklis yra n=1,515. Kai kaip terpė naudojamas kedro aliejus, skaitmeninė diafragma gali siekti daugiau nei 1,2. Štai kodėl kai kuriais atvejais naudojami aliejiniai akiniai. Šiuo metu didžiausia skaitmeninė diafragma, kurią gali pasiekti alyvos objektyvas, yra 1,4.
(2) Rezoliucija
Rezoliucija taip pat vadinama diskriminacijos rodikliu arba skiriamąja geba. Vadinamoji skiriamoji geba reiškia mikroskopo gebėjimą atskirti smulkią tiriamo objekto struktūrą. Jis yra atvirkščiai proporcingas skiriamosios gebos atstumui. Rezoliucijos atstumas reiškia mažiausią atstumą tarp dviejų objekto taškų, kuriuos galima atskirti. Kuo mažesnis skiriamosios gebos atstumas, tuo didesnė mikroskopo skiriamoji geba. Jei atstumas tarp dviejų objekto taškų yra mažesnis nei skiriamosios gebos atstumas, du taškai bus supainioti su vienu tašku, o jo struktūra nebus aiškiai matoma. Mikroskopo skiriamąją gebą lemia objektyvo lęšis. Okuliarai tik padidina ir nepadidina mikroskopo skiriamosios gebos.
Esant normaliam centriniam apšvietimui, objektyvo lęšio skiriamosios gebos atstumas d nustatomas pagal šią formulę.
d=(λ/2)N.A.
Formulėje: d reiškia skiriamosios gebos atstumą, vienetas yra mikronas, λ reiškia apšvietimo šviesos bangos ilgį, vienetas taip pat yra mikronas.
Matomoje šviesoje didžiausio ryškumo ir jautriausio žmogaus akims bangos ilgis yra {{0}},55 μm, o didžiausia objektyvo NA yra 1,4. Pakeitus aukščiau pateiktą formulę, d yra maždaug 0,2 μm. Tai reiškia, kad naudojant įprastą optinį mikroskopą skiriamosios gebos atstumo riba yra 0,2 μm centrinio apšvietimo atveju. Tai reiškia, kad įprasti optiniai mikroskopai negali atskirti dviejų objektų, mažesnių nei 0,2 μm.
Naudojant ultravioletinę šviesą, apšvietimo šviesos bangos ilgis gali būti sumažintas, todėl skiriamosios gebos atstumas pasiekia 0,1 μm. Tačiau ultravioletinių spindulių žmogaus akis nemato. Tai galima pastebėti tik nufotografavus.
Elektronų srauto bangos ilgis yra tik 0,00387 nm. Naudojant „elektroninį lęšį“ arba magnetinį lęšį elektronų srautui valdyti, elektroninio mikroskopo skiriamosios gebos atstumas yra iki kelių dešimtųjų nanometrų. Jis gali būti naudojamas stebėti atomų struktūrą.
(3) Didinimas
Mikroskopo padidinimas lygus objektyvo lęšio ir okuliaro padidinimo sandaugai. Iš esmės padidinimas gali būti labai didelis. Tačiau jei objektyvo objektyvas negali išspręsti bandinio detalių, nesvarbu, koks didinimas būtų, tai beprasmiška. Teoriškai galima daryti išvadą, kad tinkamiausias mikroskopo padidinimas (vadinamas efektyviuoju padidinimu, efektyviai pavaizduotas M) yra nuo 500 iki 1000 kartų didesnis už objektyvo objektyvo skaitinę diafragmą. Tai yra, 500 N.A. Mažesnis arba lygus M efektyvus Mažesnis arba lygus 1000N.A.
Esant efektyviam padidinimo diapazonui, akys gali stebėti ilgą laiką be nuovargio. Jei padidinimas yra mažesnis nei 500 NA, tai bus sunku stebėti. Jei jis didesnis nei 1000 N.A., tai pablogins vaizdo kokybę ir netgi sukels netikrą vaizdą. Todėl padidinimas virš 1000 N.A. vadinamas netinkamu padidinimu.
(4) Darbinis atstumas
Darbinis atstumas reiškia atstumą tarp apatinio objektyvo lęšio paviršiaus ir viršutinio dengiančiojo stiklo paviršiaus po to, kai mikroskopas sufokusuotas, naudojant standartinį dengiamąjį stiklą ir standartinį mechaninio vamzdelio ilgį. Kuo didesnis objektyvo objektyvo padidinimas, tuo trumpesnis darbo atstumas. Paprastai mažos galios objektyvo, mažesnio nei 10 karto, veikimo atstumas yra 5-7 mm, o 100 kartų alyvos objektyvo veikimo atstumas yra tik apie 0,19 mm.
(5) Fokusavimo gylis
Mikroskopą sufokusavus į tam tikrą bandinio plokštumą, galima aiškiai matyti ne tik objekto plokštumą, bet ir tuo pačiu aiškiai matyti su juo sujungtos viršutinės ir apatinės objekto plokštumos. Atstumas tarp viršutinės ir apatinės objekto plokštumų vadinamas fokusavimo gyliu arba trumpai – fokusavimo gyliu.
Mikroskopo židinio gylis yra labai mažas, ir kuo didesnė skaitmeninė diafragma, tuo didesnis bendras padidinimas ir mažesnis fokusavimo gylis. Pavyzdžiui, naudojant aliejinį lęšį, kurio NA yra 1,25/100 karto ir 12,5 karto okuliarą, fokusavimo gylis yra tik 0,27 μm. Tai reiškia, kad po fokusavimo vienu metu aiškiai matomas tik plonas 0,27 μm storio sluoksnis. Paprasti pavyzdžiai paprastai yra kelių mikronų storio. Norint pamatyti visą mėginį, būtina naudoti mikroskopo koregavimo mechanizmą, kad būtų galima stebėti sluoksniais nuo viršaus iki apačios.
(6) matymo laukas
Matymo laukas taip pat vadinamas matymo lauku. Nurodo tikrinamo objekto apimtį, kurią vienu metu gali matyti mikroskopas. Paprastai norime, kad matymo laukas būtų kuo didesnis. Mikroskopo matymo laukas nustatomas pagal objektyvo lęšio ir okuliaro matymo lauką. Įprasto objektyvo matymo laukas yra mažesnis nei 20 mm, o didelis gali siekti daugiau nei 40 mm. Įprastų 10x okuliarų matymo laukas yra 14 mm, o didelių gali siekti daugiau nei 24 mm. Sukūrus objektyvą ir okuliarą, jų matymo laukas fiksuojamas. Kadangi bendrojo mikroskopo matymo laukas yra mažas, neįmanoma pamatyti viso bandinio viename matymo lauke, matosi tik labai mažas apskritimas ant bandinio. Be to, regėjimo lauko dydis yra atvirkščiai proporcingas bendram mikroskopo padidinimui. Kuo didesnis bendras padidinimas, tuo mažesnis matymo laukas. Sprendimas yra naudoti judiklį, kad kiekviena bandinio dalis paeiliui patektų į regėjimo lauką ir paeiliui būtų stebima.
(7) Veidrodžio šviesumas
Veidrodžio ryškumas reiškia objekto vaizdo, matomo mikroskopu, šviesumą ir tamsumą. Kad būtų lengviau stebėti, tikimės, kad vaizdas bus ryškesnis. Esant pastoviai išorinei šviesai, veidrodžio ryškumas yra proporcingas skaitmeninės diafragmos kvadratui ir atvirkščiai proporcingas viso padidinimo kvadratui. Kad vaizdas būtų ryškesnis, su mažo padidinimo okuliaru reikia naudoti objektyvą su didele skaitmenine diafragma. Pavyzdžiui, naudojant tą patį objektyvą, naudojant 5X okuliarą, veidrodinis vaizdas bus 4 kartus ryškesnis nei naudojant 10X okuliarą.
Mikroskopuose, kuriuose naudojami elektriniai šviesos šaltiniai, veidrodinio vaizdo ryškumą galima reguliuoti reguliuojant iliuminatoriaus ryškumą.
(8) Aiškumas
Mikroskopo vaizdo aiškumas priklauso nuo jo optinės sistemos, ypač nuo objektyvo lęšio optinių savybių. Jis susijęs su mikroskopų projektavimu, gamyba, naudojimu ir laikymu. Tai svarbus ir sudėtingas klausimas. Naudojimo ir laikymo požiūriu pagrindinės priežastys, turinčios įtakos aiškumui, yra šios: naudojamas dengiamojo stiklo storis nekvalifikuotas, fokusas nesureguliuotas į idealią padėtį, bendras padidinimas per didelis ir alyvos lęšis. objektyvas nenuvalytas. Švarus, objektyvas pelėsis ir kt.
