Daugiafotoninis mikroskopinis vaizdavimas: įvairūs neuronų vaizdavimo in vivo metodai
Palyginti su tradiciniu vieno fotono plataus lauko fluorescenciniu mikroskopu, daugiafotoninė mikroskopija (MPM) turi optinio pjūvio ir gilaus vaizdo funkcijas. 2019 m. Jerome'as Lecoqas ir kt. aptarė susijusią MPM technologiją iš trijų aspektų: neuronų vaizdavimo giliai smegenyse, masinio neuronų vaizdavimo ir didelės spartos neuronų vaizdavimo.
Norint susieti neuronų aktyvumą su sudėtingu elgesiu, paprastai reikia vaizduoti neuronus giliojoje žievėje, todėl MPM turi turėti gilaus vaizdo gebėjimą. Sužadinimo ir emisijos šviesa bus labai išsklaidyta ir sugerta biologinio audinio, o tai yra pagrindinis veiksnys, ribojantis MPM vaizdo gylį. Nors sklaidos problemą galima išspręsti padidinus lazerio intensyvumą, tai sukels kitų problemų, tokių kaip mėginio deginimas, fokusavimas ir arti paviršiaus fluorescencinis sužadinimas. Geriausias būdas padidinti MPM vaizdo gylį yra naudoti ilgesnius bangos ilgius kaip sužadinimo šviesą.
Be to, atliekant dviejų fotonų (2P) vaizdavimą, nesufokusuotas ir arti paviršiaus esantis fluorescencinis sužadinimas yra du didžiausi gylį ribojantys veiksniai, o atliekant trijų fotonų (3P) vaizdavimą šios dvi problemos yra labai sumažintos, tačiau trijų fotonų vaizdavimas dėl fluorescencijos Grupės sugerties skerspjūvis yra daug mažesnis nei 2P, todėl norint gauti tokio pat intensyvumo fluorescencijos signalą, kaip ir 2P, reikalinga eilės tvarka didesnė impulso energija. Funkcinė 3P mikroskopija yra reiklesnė nei struktūrinė 3P mikroskopija, kuriai reikalingas greitesnis nuskaitymas, norint laiku nustatyti neuronų aktyvumą; Norint surinkti pakankamai signalų per kiekvieno pikselio išlikimo laiką, reikalinga didesnė impulsų energija.
Sudėtingas elgesys dažnai apima didelius smegenų tinklus su vietiniais ir ilgalaikiais ryšiais. Norint susieti neuronų aktyvumą su elgesiu, būtina tuo pačiu metu stebėti labai didelių ir plačiai paplitusių neuronų veiklą. Neuroninis tinklas smegenyse apdoroja gaunamus dirgiklius per keliasdešimt milisekundžių. Norint suprasti šį greitą neuronų tinklą Norint ištirti neuronų dinamiką, MPM reikalingas gebėjimas greitai atvaizduoti neuronus. Greituosius MPM metodus galima suskirstyti į vieno pluošto skenavimo būdus ir kelių pluoštų skenavimo būdus.
Vieno spindulio skenavimo technologija leidžia greitai pereiti per nervinį audinį su dideliu matymo lauku (FOV)
Naudojant MPM neuronams vaizduoti, atsitiktinės prieigos skenavimas, ty lazerio spindulys greitai nuskaitomas bet kuriame pasirinktame viso regėjimo lauko taške, gali nuskaityti tik dominančius neuronus, todėl ne tik išvengiama bet kokių nepažymėtų nervinių skaidulų nuskaitymo. taip pat optimizuoti lazerio spindulio skenavimo laiką. Atsitiktinės prieigos nuskaitymą (1 pav.) galima pasiekti naudojant akustinį-optinį deflektorių (AOD), kuris veikia sujungus pjezoelektrinį keitiklį su radijo dažnio signalu prie tinkamo kristalo. Susidariusios akustinės bangos sukelia periodinę lūžio rodiklio gardelę. Difrakcija atsiranda, kai lazerio spindulys praeina per gardelę. Garso bangos intensyvumą ir dažnį galima reguliuoti radijo dažnio elektriniu signalu, kad būtų pakeistas išsklaidytos šviesos intensyvumas ir kryptis, kad naudojant vieną AOD būtų galima atlikti vienmatį horizontalų savavališką taškinį nuskaitymą ir realizuoti 3D. naudojant porą AOD kartu su kitomis ašinio nuskaitymo technologijomis atsitiktinės prieigos nuskaitymu. Tačiau šis metodas yra labai jautrus mėginio judėjimui ir yra linkęs į judėjimo artefaktus. Šiuo metu spartus rastrinis nuskaitymas, ty progresinis nuskaitymas FOV, yra plačiai naudojamas, nes algoritmas gali lengvai išspręsti judesio artefaktus.
AOD pagrįstas dviejų fotonų neokortikinių L2/3 neuronų vaizdavimas in vivo[2]
Yra daug būdų, kaip atlikti greitą rastrinį nuskaitymą, naudojant vibruojantį veidrodį greitam 2D nuskaitymui, derinant vibruojantį veidrodį ir reguliuojamą elektrinį lęšį greitam 3D nuskaitymui, tačiau reguliuojamas elektrinis objektyvas negali greitai sufokusuoti ašies kryptimi dėl apribojimų. mechaninė inercija Perjungimas, turintis įtakos vaizdo greičiui, dabar gali būti pakeistas erdviniu šviesos moduliatoriumi (SLM).
Nuotolinis fokusavimas taip pat yra priemonė 3D vaizdavimui pasiekti, kaip parodyta 2 paveiksle. LSU modulyje skenuojantis galvanometras nuskaito horizontaliai, o ASU modulyje yra objektyvo lęšis L1 ir veidrodis M, o ašinis skenavimas vykdomas reguliuojant M padėtis. Ši technika gali ne tik ištaisyti pagrindinio objektyvo L2 sukeltą optinę aberaciją, bet ir įgalinti greitą ašinį nuskaitymą. Norint gauti daugiau neuronų vaizdų, FOV galima padidinti koreguojant mikroskopo objektyvo konstrukciją, tačiau objektyvo lęšis su dideliu NA ir dideliu FOV paprastai yra sunkus ir negali greitai judėti, kad būtų galima greitai nuskaityti ašinį, todėl didelės FOV sistemos remiasi telefokusu. , SLM ir reguliuojami motorizuoti lęšiai.
Nuotolinio fokusavimo dviejų fotonų vaizdavimo sistemos schema[3] Kelių spindulių skenavimo technologija gali vienu metu vaizduoti skirtingas neuronų audinio padėtis
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm atstumu vienas nuo kito) vaizdo gavimo vietos (3C, D pav.); gretimose srityse paprastai vaizdavimui naudojami keli vieno objektyvo spinduliai (3E, F pav.). Kelių spindulių skenavimo technika turi skirti ypatingą dėmesį sužadinimo pluoštų skersinio pokalbio problemai, kurią galima išspręsti naudojant post-šviesos šaltinio atskyrimo metodą arba erdvės ir laiko multipleksavimo metodą. Post-hoc šviesos šaltinio atskyrimo metodas – tai algoritmų naudojimas pluoštams atskirti, kad būtų pašalintas skersinis pokalbis; Laiko ir erdvės tankinimo metodas reiškia kelių sužadinimo pluoštų naudojimą vienu metu, kiekvieno pluošto impulsai yra uždelsti laike, kad būtų galima laikinai atskirti atskirus pluoštus, sužadinamus skirtingų pluoštų. fluorescencinis signalas. Įvedant daugiau pluoštų galima pavaizduoti daugiau neuronų, tačiau keli pluoštai padidins fluorescencijos skilimo laiko sutapimą, o tai riboja galimybę atskirti signalo šaltinius; o tankinimas neigiamai veikia elektroninių prietaisų darbo greitį. Aukšti reikalavimai; dideliam spindulių skaičiui taip pat reikalinga didesnė lazerio galia, kad būtų išlaikytas apytikslis vieno pluošto signalo ir triukšmo santykis, o tai gali lengvai sukelti audinių pažeidimus.
Didelio ploto vaizdo gavimo technologija
Pastaraisiais metais įvairių MPM technologijų kūrimas išplėtė nervinio audinio vaizdavimo apimtį, o tai leido mums greičiau vaizduoti daugiau giliai smegenyse esančių neuronų, o tai labai paskatino neurologijos tyrimus ir leido mums įgyti aiškesnį supratimą. smegenų funkcijos.
