Daugiafotonų mikroskopų židinio gylio padidinimo metodai
Dviejų{0}}fotonų lazerinio skenavimo mikroskopo ir kalcio indikatoriaus derinys yra auksinis neuronų signalo aptikimo in vivo standartas. Neuronų tinklų neuronai yra paskirstyti trimatėje erdvėje, todėl norint stebėti jų veiklos dinamiką reikia greitai pagerinti vaizdo tūrio greitį. Tačiau naudojant grotelių skenuojantį daugiafotoninį mikroskopą, kad būtų galima nufotografuoti daug vaizdų, jei naudojamas didelės skaitmeninės diafragmos (NA) objektyvas, norint pasiekti didesnę šoninę skiriamąją gebą, židinio gylis bus mažesnis. Norint gauti tūrinį vaizdą esant mažam židinio gyliui,
Būtina atlikti Z-ašies nuskaitymą tam tikromis priemonėmis, vaizduojant daug plokštumų, nuskaitant kiekvieną židinio plokštumą, o tai labai apriboja vaizdo greitį. Jei galima paaukoti ašinio vaizdo informaciją ir vieno šoninio nuskaitymo metu galima pasiekti tūrio nuskaitymą padidinus fokusavimo gylį, tai yra, apimties informacija projektuojama į vieną 2D vaizdą, vaizdo gavimo greitis gali būti žymiai pagerintas. Tai vadinama išplėstinio fokusavimo gylio (EDF) vaizdavimu, kuris ypač naudingas vaizduojant negausias populiacijos struktūras, kurioms reikalinga didelė laiko skiriamoji geba, pvz., funkciniam neuronų aktyvumo vaizdavimui.
Ašinę ir šoninę mikroskopo skiriamąją gebą lemia objektyvo lęšio skaitmeninė diafragma (NA). Didelė NA gali maksimaliai padidinti ašinę ir šoninę skiriamąją gebą, taip pat surenkamos šviesos kiekį; Mažesnė NA sukels mažesnę ašinę skiriamąją gebą, ty didesnį fokusavimo gylį, bet tuo pačiu paaukos šoninę skiriamąją gebą ir šviesos surinkimo efektyvumą. Fokusavimo gylio padidinimo metodas, kuris bus pristatytas vėliau, gali tai pasiekti išlaikant didelę šoninę skiriamąją gebą ir pakankamą šviesos srautą.
Naudojant erdvinius šviesos moduliatorius, kad būtų sukurti ploni Besselio spinduliai, galima gauti EDF vaizdą, tačiau erdviniai šviesos moduliatoriai yra nepatogūs ir sunkiai suderinami su siauromis mikroskopo erdvėmis; Priešingai, Besselio moduliai, pagrįsti ašinėmis piramidėmis, yra pigūs ir kompaktiški, tačiau jie gali generuoti tik fiksuoto gylio židinio taškus ir netinka įvairiems eksperimentams, kuriems reikia nuolat keisti židinio gylį. Norėdami išspręsti šią problemą, 2018 m. RONGWEN LU ir kt. pademonstravo Besselio modulį, pagrįstą ašimi, kuriame išilgai optinės ašies reikia išversti tik vieną objektyvą, kad būtų galima nuolat reguliuoti Besselio židinio taško ašinį ilgį.
1 paveikslas a) Besselio modulio įrenginio schema; (b) taško plitimo funkcija buvo eksperimentiškai išmatuota, kai D buvo atitinkamai -12 mm, 0 mm ir 12 mm; c) Ryšys tarp šoninio viso pločio iki pusės didžiausio, d) viso ašinio pločio iki pusės didžiausio, e) didžiausio signalo ir f) optinės galios už objektyvo su L2 poslinkiu D
Modulio įtaisas, skirtas formuoti kintamo ilgio Besselio židinio tašką, parodytas 1a paveiksle. Kritęs Gauso spindulys yra suformuotas į apskritą pluoštą, kai jis praeina per ašį ir lęšį L1. Vėlesnė apskritos diafragmos kaukė gali blokuoti išsklaidytą šviesą, kurią sukelia ašies defektai, ir taip suformuoti dviejų -fotonų sužadinimo taškų sklaidos funkcijos ašinį pasiskirstymą. Po to šviesos spindulys projektuojamas ant galvanometro lęšiais L2 ir L3, o po to per lęšius L4 ir L5 pasiekia galinę objektyvo židinio plokštumą.
Šios konstrukcijos yra panašios į tradicinius piramidės pagrindu veikiančius modulius, tačiau skirtumas yra tas, kad judant L2 arba L3 išilgai optinės ašies, Besselio židinio ašinį ilgį galima nuolat reguliuoti. 1b paveiksle parodytos ašinio taško sklaidos funkcijos, kai D reikšmės yra -12 mm, 0 mm ir 12 mm, o ašinis visas plotis yra 39? m,24? M ir 14? m. Kaip parodyta 1c-f paveiksle, perkeliant objektyvą L2 iš kairės į dešinę, galima nuolat keisti visą plotį iki pusės maksimumo tiek skersine, tiek ašine kryptimis, o tai reiškia, kad fokusavimo gylis gali būti nuolat keičiamas. Skaitinio modeliavimo rezultatai, pagrįsti vektorinės difrakcijos teorija, gerai sutampa su eksperimentiniais duomenimis. 2 paveiksle parodytas skirtingų dydžių žiedinių kaukių korekcijos poveikis ašies defektams. Nustatyta, kad plonesnės žiedinės kaukės gali geriau optimizuoti išėjimo Besselio pluošto ašinį intensyvumo pasiskirstymą, tačiau tuo pat metu jos taip pat praranda daugiau galios.
