Fluorescencinės mikroskopijos įvadas
Fluorescencinė mikroskopija yra apšvitinti fluoresceinu nudažytą objektą trumpos bangos šviesa, kad jis būtų sužadintas, kad susidarytų ilgos bangos fluorescencija, ir tada stebimas. Fluorescenciniame mikroskope tam tikro bangos ilgio sužadinimo šviesa turi būti parinkta iš bandinio apšvietimo šviesos, kad būtų sukurta fluorescencija, o tada fluorescencija turi būti atskirta nuo mišrios sužadinimo šviesos ir fluorescencijos šviesos, kad būtų galima stebėti. Todėl filtrų sistema atlieka itin svarbų vaidmenį parenkant konkretų bangos ilgį. Fluorescenciniai mikroskopai plačiai naudojami biologijoje, medicinoje ir kitose srityse.
1. Pagrindiniai fluorescencinio mikroskopo komponentai:
(A) Šviesos šaltinis: šviesos šaltinis spinduliuoja įvairaus bangos ilgio šviesą (nuo ultravioletinių iki infraraudonųjų). į
(B) Sužadinimo filtro šviesos šaltinis: per tam tikro bangos ilgio šviesą, dėl kurios mėginys gali fluorescencuoti, tuo pačiu blokuodamas šviesą, kuri yra nenaudinga jaudinančiai fluorescencijai. į
(C) Fluorescenciniai mėginiai: dažniausiai nudažyti fluorescenciniais pigmentais. į
(D) Blokuojantis filtras: blokuokite sužadinimo šviesą, kurios nesugeria mėginys, ir selektyviai perduoda fluorescenciją, o kai kurie bangos ilgiai yra selektyviai perduodami fluorescencijoje.
į
2. Fluorescencinių mikroskopų klasifikacija:
Fluorescenciniai mikroskopai paprastai skirstomi į du tipus: perdavimo ir epi-emisijos:
a. Perdavimo tipas: sužadinimo šviesa sklinda iš tikrinamo objekto apačios, o kondensatorius yra tamsaus lauko kondensatorius, todėl sužadinimo šviesa nepatenka į objektyvo lęšį, o fluorescencija patenka į objektyvo lęšį. Mažai padidinus jis yra šviesus, o esant dideliam padidinimui – tamsus. Sunku dirbti panardinant alyvą ir centruojant. Ypač sunku nustatyti apšvietimo diapazoną esant mažam padidinimui, tačiau jis gali gauti labai tamsų matymo lauko foną. Perdavimo tipas nenaudojamas neskaidriems objektams. į
b. Epi tipas: šiuo metu transmisijos tipas beveik panaikintas. Dauguma naujų fluorescencinių mikroskopų yra epi tipo. Šviesos šaltinis ateina iš viršaus tikrinamo objekto, o optiniame kelyje yra pluošto skirstytuvas, todėl tinka tiek skaidriems, tiek nepermatomiems objektams tikrinti. Kadangi objektyvas veikia kaip kondensatorius, jį ne tik lengva valdyti, bet ir galima pasiekti vienodą viso regėjimo lauko apšvietimą nuo mažo padidinimo iki didelio padidinimo. į
į
3. Atsargumo priemonės atliekant fluoroskopiją
a. Ilgalaikis sužadinimo šviesos švitinimas sukels fluorescencijos susilpnėjimą ir gesinimą, todėl kiek įmanoma sutrumpinkite stebėjimo laiką ir naudokite pertvarą, kad uždengtumėte sužadinimo šviesą, kai laikinai nestebite. į
b. Stebėdami su panardinamuoju lęšiu, naudokite „nefluorescencinę alyvą“. į
c. Fluorescencija beveik visada yra silpna ir turėtų būti atliekama tamsioje patalpoje. į
d. Geriausia maitinimo šaltinyje sumontuoti įtampos stabilizatorių, kitaip nestabili įtampa ne tik sumažins gyvsidabrio lempos tarnavimo laiką, bet ir paveiks mikroskopinio patikrinimo efektą. į
į
4. Fluorescencinės mikroskopijos naudojimas
1. Fluorescencinio mikroskopo bandinių paruošimo reikalavimai
a. Stiklinė skaidrė
Stiklo stiklelio storis turi būti nuo 0,8 iki 1,2 mm. Per storas stiklelis, viena vertus, sugers daugiau šviesos, kita vertus, sužadinimo šviesa negali būti sutelkta ant bandinio. Skaidrės turi būti lygios, vienodo storio ir be akivaizdžios autofluorescencijos. Kartais naudojamos kvarcinio stiklo skaidrės. į
b. Dengiamas stiklas
Dengiamojo stiklo storis yra apie 0,17 mm, lygus. Siekiant sustiprinti sužadinimo šviesą, taip pat galima naudoti sausą dengiamąjį stiklą, kuris yra specialus dengiantis stiklas, padengtas keliais sluoksniais medžiagų (pvz., magnio fluorido), kurios turi skirtingą trukdžių poveikį skirtingo bangos ilgio šviesai, todėl gali būti fluorescencija vyksta sklandžiai. Praleidžiama sužadinimo šviesa, o atspindėta sužadinimo šviesa sužadina bandinį. į
c. Pavyzdys
Audinių griežinėliai ar kiti mėginiai neturi būti per stori. Jei jis per storas, didžioji dalis sužadinimo šviesos bus sunaudota apatinėje bandinio dalyje, o viršutinė dalis, kurią tiesiogiai stebi objektyvo lęšis, negali būti visiškai sužadinta. Be to, ląstelių sutapimas arba priemaišos uždengia, o tai turi įtakos sprendimui. į
d. Montavimo agentas
Glicerinas dažniausiai naudojamas kaip tvirtinimo priemonė, kuri turi būti be autofluorescencijos, bespalvė ir skaidri, o fluorescencijos ryškumas yra ryškesnis, kai pH 8.{1}}.5, ir nėra lengva greitai išblukti. Todėl kaip tvirtinimo priemonė paprastai naudojamas vienodas glicerolio ir 0,5 mol/l karbonato buferinio tirpalo, kurio pH nuo 9.0 iki 9,5, mišinys. į
e. veidrodinis aliejus
Paprastai imersinė alyva turi būti naudojama stebint mėginius tamsaus lauko fluorescenciniais mikroskopais ir panardinamaisiais aliejaus objektyvais. Geriausia naudoti specialią nefluorescencinę veidrodinę alyvą, kurią taip pat galima pakeisti minėtu glicerinu, taip pat galima naudoti skystą parafiną, tačiau lūžio rodiklis mažas, o tai šiek tiek paveikia vaizdo kokybę.
