Fluorescencinio mikroskopo principo taikymas ir naudojimas
(1) Fluorescencinio mikroskopo principas ir struktūrinės charakteristikos: fluorescencinis mikroskopas naudoja taškinį šviesos šaltinį, turintį didelį šviesos efektyvumą, kad išspinduliuotų tam tikro bangos ilgio šviesą (pvz., ultravioletinę šviesą 3650 colių arba violetinę mėlyną šviesą 4200 colių) per filtrų sistemą. kaip sužadinimo šviesa bandiniui sužadinti. Kai viduje esanti fluorescencinė medžiaga skleidžia įvairių spalvų fluorescenciją, tai stebima padidinus objektyvo lęšį ir okuliarą. Tokiu būdu, esant stipriam kontrastiniam fonui, net jei fluorescencija yra labai silpna, ją lengva atpažinti ir jos jautrumas yra didelis. Jis daugiausia naudojamas ląstelių struktūros ir funkcijos bei cheminės sudėties tyrimams. Pagrindinę fluorescencinio mikroskopo struktūrą sudaro įprastas optinis mikroskopas ir kai kurie priedai (pvz., fluorescencinis šviesos šaltinis, sužadinimo filtras, dviejų spalvų pluošto skirstytuvas ir blokuojantis filtras ir kt.). Fluorescencinis šviesos šaltinis – paprastai naudojama itin aukšto slėgio gyvsidabrio lempa (50-200W), kuri gali skleisti įvairaus bangos ilgio šviesą, tačiau kiekviena fluorescencinė medžiaga turi sužadinimo bangos ilgį, kuris sukuria stipriausią fluorescenciją, todėl sužadinimo filtras ( Paprastai yra ultravioletinių, violetinių, mėlynų ir žalių sužadinimo filtrai), kurie leidžia tik tam tikro bangos ilgio sužadinimo šviesai praeiti ir apšvitinti bandinį, o sugerti kitą šviesą. Po to, kai kiekviena medžiaga yra apšvitinta sužadinimo šviesa, ji per labai trumpą laiką skleidžia matomą fluorescenciją, kurios bangos ilgis yra ilgesnis nei švitinimo bangos ilgis. Fluorescencija yra specifinė ir paprastai silpnesnė nei sužadinimo šviesa. Norint stebėti specifinę fluorescenciją, už objektyvo lęšio reikalingas blokuojantis (arba slopinantis) filtras. Ji atlieka dvi funkcijas: viena – sugerti ir blokuoti sužadinimo šviesą, kad ji nepatektų į okuliarą, kad nebūtų sutrikdyta fluorescencija ir nepažeistų akių; kitas yra pasirinkti ir leisti specifinei fluorescencijai praeiti, rodant specifinę fluorescencinę spalvą. Du filtrai turi būti naudojami kartu.
Atsižvelgiant į jų optinius kelius, yra dviejų tipų fluorescenciniai mikroskopai:
1. Perdavimo fluorescencinis mikroskopas: sužadinimo šviesos šaltinis pro mėginio medžiagą per kondensatoriaus lęšį praleidžiamas fluorescencijai sužadinti. Paprastai naudojamas tamsaus lauko kolektorius, o įprastu kolektorius taip pat galima reguliuoti veidrodį taip, kad sužadinimo šviesa būtų nukreipta ir apeinama į bandinį. Tai senesnis fluorescencinis mikroskopas. Privalumas yra tas, kad fluorescencija yra stipri esant mažam padidinimui, tačiau trūkumas yra tas, kad fluorescencija mažėja didėjant didinimui. Todėl geriau stebėti didesnių bandinių medžiagas.
2. Epifluorescencinis mikroskopas yra naujo tipo fluorescencinis mikroskopas, sukurtas šiais laikais. Skirtumas tas, kad sužadinimo šviesa nukrenta nuo objektyvo į bandinio paviršių, tai yra, tas pats objektyvas naudojamas kaip apšvietimo kondensatorius ir objektyvas fluorescencijai surinkti. Šviesos kelyje, kuris yra 45 laipsnių atstumu nuo šviesaus urano, reikia pridėti dichroinio pluošto skirstytuvą. Sužadinimo šviesa atsispindi objektyvo lęšyje ir surenkama ant mėginio. Mėginio generuojama fluorescencija ir sužadinimo šviesa, kurią atspindi objektyvo lęšio lęšio paviršius ir dengiančiojo stiklo paviršius, tuo pačiu metu patenka į objektyvo lęšį ir grįžta į dviejų spalvų pluošto skirstytuvą, kad sužadinimo šviesa būtų atskirta nuo fluorescencijos. , likutinę sužadinimo šviesą sugeria blokuojantys filtrai. Pavyzdžiui, pakeitus skirtingų sužadinimo filtrų / dviejų spalvų pluošto skirstytuvo / blokuojančių filtrų derinį, jis gali patenkinti skirtingų fluorescencinių reakcijos produktų poreikius. Šio tipo fluorescencinio mikroskopo pranašumas yra tas, kad matymo lauko apšvietimas yra vienodas, vaizdas yra aiškus ir kuo didesnis padidinimas, tuo stipresnė fluorescencija.
(2) Kaip naudoti fluorescencinį mikroskopą.
1. Įjunkite šviesos šaltinį ir itin aukšto slėgio gyvsidabrio lempa turi keletą minučių sušilti, kad pasiektų ryškiausią tašką.
2. Perdavimo fluorescenciniame mikroskope tarp šviesos šaltinio ir kondensatoriaus reikia sumontuoti reikiamą sužadinimo filtrą, o už objektyvo lęšio – atitinkamą blokuojantį filtrą. Epifluorescenciniai mikroskopai turi įterpti reikiamą sužadinimo filtrą/dviejų spalvų pluošto skirstytuvą/blokavimo filtrą į šviesos kelio plyšius.
3. Stebėkite su mažo didinimo lęšiu ir nustatykite šviesos šaltinio centrą taip, kad jis būtų visos apšvietimo taško centre pagal skirtingų modelių fluorescencinių mikroskopų reguliavimo įtaisą.
4. Padėkite mėginio gabalėlį ir sufokusavus stebėkite. Naudojimo metu reikia atkreipti dėmesį: nežiūrėkite tiesiai į galinį filtrą, kad nepažeistumėte akių; stebint bandinius su alyvos lęšiu, turi būti naudojamas specialus aliejinis lęšis be fluorescencijos; išjungus aukšto slėgio gyvsidabrio lempą, jos iš karto vėl įjungti negalima, ją reikia išbandyti. Jį galima paleisti iš naujo po 5 minučių, kitaip jis bus nestabilus ir turės įtakos gyvsidabrio lempos tarnavimo laikui.
(3) Stebėkite ląsteles, nudažytas 0,01 procento akridino oranžinės spalvos fluorescenciniais dažais, po fluorescenciniu mikroskopu ant mokymo platformos su mėlynai violetinės šviesos filtru. Branduolys ir citoplazma sužadinami, kad susidarytų dvi skirtingos fluorescencijos spalvos (tamsiai žalia ir oranžinė raudona).
