Fluorescencinio mikroskopo ir įprasto optinio mikroskopo skirtumai ir charakteristikos
Fluorescencinis mikroskopas skiriasi nuo įprasto optinio mikroskopo. Jis nestebi bandinio per įprasto šviesos šaltinio apšvietimą. Vietoj to, jis naudoja tam tikro bangos ilgio šviesą (dažniausiai ultravioletinę šviesą, mėlynai violetinę šviesą), kad sužadintų fluorescencinę medžiagą, esančią mėginyje po mikroskopu, todėl ji skleidžia fluorescenciją. Todėl fluorescencinio mikroskopo šviesos šaltinis tarnauja ne kaip tiesioginis apšvietimas, o kaip energijos šaltinis, sužadinantis vidinę fluorescencinę bandinio medžiagą. Priežastis, kodėl mes galime stebėti bandinį, yra ne dėl šviesos šaltinio apšvietimo, o dėl fluorescencijos reiškinio, kurį sukelia fluorescencinė medžiaga bandinyje, sugerianti sužadintą šviesos energiją. Matyti, kad pagrindinė fluorescencinio mikroskopo savybė yra ta, kad jo šviesos šaltinis gali tiekti didelį kiekį sužadinimo šviesos tam tikrame bangos ilgio diapazone, todėl tiriamame bandinyje esančios fluorescencinės medžiagos gali gauti reikiamą sužadinimo šviesos intensyvumą. Tuo pačiu metu fluorescenciniai mikroskopai turi turėti atitinkamas filtrų sistemas. Fluorescencinė mikroskopija yra pagrindinė pažangios fluorescencinės histochemijos priemonė. Jį sudaro itin aukšto slėgio šviesos šaltinis, filtrų sistema (įskaitant sužadinimo ir slopinimo filtrų plokštes), optinė sistema ir fotografavimo sistema. Jis naudoja tam tikro bangos ilgio šviesą, kad sužadintų bandinį, kad skleistų fluorescenciją.
1. Fluorescencijos sužadinimo būdai: Pagal šviesos bangos ilgio diapazoną ji skirstoma į du tipus: UV sužadinimo metodą (naudojant ultravioletinio apšvietimo metodą) ir BV sužadinimo metodą (naudojant mėlynai violetinę šviesą). Taikant UV sužadinimo metodą, sužadinimui naudojama beveik ultravioletinė šviesa, trumpesnė nei 400 nm. Taikant šį metodą nėra matomos sužadinimo šviesos, todėl stebima fluorescencija rodo būdingą dažų fluorescenciją, todėl lengva atskirti specifinę bandinio fluorescenciją nuo foninio audinio autofluorescencijos.
2. BV sužadinimo metodas: sužadinimas nuo ultravioletinės iki mėlynos šviesos, kurių centras yra 404 nm ir 434 nm. Šiuo metodu bandiniui apšviesti naudojama mėlyna šviesa, todėl fluorescencijos stebėjimo sistemos ribiniame filtre turi būti naudojamas filtras, kuris gali visiškai blokuoti mėlyną šviesą ir visiškai praleisti reikiamą žalią ir geltoną fluorescenciją. Fluorescenciniai dažai, naudojami fluorescencinių antikūnų metoduose. Didžiausias sužadinimo šviesos sugerties bangos ilgis ir didžiausias fluorescencijos emisijos bangos ilgis yra santykinai artimi, todėl BV sužadinimo metodu naudojamas filtras turi naudoti aštrų ribinį filtrą. Šis metodas gali naudoti mėlyną šviesą kaip sužadinimo šviesą, todėl fluorescencinių pigmentų sugerties efektyvumas yra didesnis ir galima gauti ryškesnius vaizdus. Trūkumas yra tas, kad fluorescencija žemiau 500 nm nesimato, o esant aukštesnei nei 500 nm fluorescencijai, visas vaizdas atrodo geltonas. Taikant fluorescencinių antikūnų metodą, fluorescuojančių dažų specifiškumas dažniausiai vertinamas pagal jo unikalią spalvą. Todėl aptariant subtilų specifiškumą dažnai didelę įtaką turi minėti BV žadinimo metodo trūkumai.
