Konfokalinės mikroskopijos raidos tendencija
Siekiant geresnių stebėjimo rezultatų techniniu lygmeniu, konfokalinė mikroskopija orientuota į techninio lygio gerinimą iš skiriamosios gebos gerinimo, fototoksiškumo mažinimo, skenavimo greičio didinimo, storų mėginių stebėjimo ir stebėjimo in vivo aspektų. Šiuo metu jis yra Z efektyvus. Tai, kas skatina Zda naudoti konfokalinės mikroskopijos technologiją, yra itin didelės skiriamosios gebos mikroskopija, kuri peržengia optinę ribą ir leidžia tyrėjams gauti smulkesnes ląstelių struktūras, o tai padeda tyrinėtojams giliau suprasti gyvenimo veiklą. Kitas konfokalinės mikroskopijos technologijos tyrimas turėtų sutelkti dėmesį į šiuos dalykus:
1. Didesnis nuskaitymo greitis
Šiuo metu konfokalinį nuskaitymo greitį riboja mechaninė nuskaitymo įrangos struktūra, o skiriamoji geba gali būti paaukota tik siekiant didesnio nuskaitymo greičio. Daugelis biologinių procesų yra tokie greiti, kad lieka nepastebimi.
2. Tobulesnė itin didelės raiškos technologija
Šiuo metu itin didelės raiškos technologijos apima STORM, PALM, STED ir SSIM, kurių skiriamoji geba svyruoja nuo 20 iki 200 nm, tačiau kiekviena technologija turi tam tikrų trūkumų, tokių kaip mėginių apdorojimas, Z ašies kryptis, fototoksiškumas ir kt. nėra beveik tobulas, ir dažnai sunku pasiekti ribinę skiriamąją gebą faktinio stebėjimo metu.
3. Stipresnis suderinamumas
Konfokalinės mikroskopijos technologija apima įvairius sužadinimo metodus, pvz., minėtą daugiafotonų ir šviesos lakštų stebėjimą, o nuosekli anti-Stokes Ramano sklaida teoriškai gali dalytis lazerinių sistemų rinkiniu. Didelės skiriamosios gebos mikroskopiją galima susieti su baltojo lazerio technologija. Tačiau dėl įvairių kompanijų patentų problemų vis dar yra kur tobulinti išsamumą ir suderinamumą, o dabartinė įranga negali visiškai išnaudoti techninių programos pranašumų.
Konfokalinės mikroskopijos principai
Konfokalinis mikroskopas susideda iš keturių dalių: mikroskopo optinės sistemos, lazerio šviesos šaltinio, skaitytuvo ir aptikimo bei apdorojimo sistemos. Jis kaip šviesos šaltinis naudoja gero koherentiškumo lazerį. Jis naudoja konjuguoto fokusavimo principą ir įrenginį, pagrįstą tradiciniu optiniu mikroskopu, ir naudoja kompiuterinį stebėjimo, analizės ir išvesties sistemos rinkinį vaizdo apdorojimui.
Lazerio skenavimo spindulys praeina per grotelių skylutę ir sudaro taškinį šviesos šaltinį, kuris per pluošto skirstytuvą atsispindi objektyvo lęšyje, sufokusuojamas į bandinį ir nuskaitomas. Mėginį sužadinus, skleidžiama fluorescencija grįžta į spektroskopą ir surenka ją į aptikimo skylutę, o tada fotodaugiklio vamzdeliu paverčiama elektriniu signalu ir perduodama į kompiuterį, kad būtų rodomas aiškus židinio plokštumos vaizdas. Sužadinimo šviesa fokusuojama į mėginį per gardelės skylutę, o fluorescencija – į skylutę per objektyvo lęšį. Šis procesas sudaro du fokusavimus, todėl jis vadinamas konfokaliniu mikroskopu.
Paprasti biologiniai mėginiai turi sudėtingą struktūrą ir tam tikrą storį. Stebint įprastu fluorescenciniu mikroskopu, mėginio skleidžiama fluorescencija persidengia viena su kita, o vaizdo skiriamoji geba labai sumažėja.
Konfokalinio mikroskopo konfokalinis vaizdas gali veiksmingai slopinti išsklaidytą šviesą ir ne matavimo šviesą už židinio plokštumos patekimo į detektorių, realizuoti vienos židinio plokštumos vaizdavimą ir labai pagerinti skiriamąją gebą. Kai scena tolygiai juda horizontalia kryptimi, ji gali sudaryti aiškų vieno sluoksnio vaizdą, o vertikalia kryptimi - sluoksnį po sluoksnio nuskaityti mėginį skirtinguose gyliuose ir gauti trimatę struktūrą. mėginio po trimatės rekonstrukcijos, kuri yra vadinamoji „optinė KT“. Mėginys paženklinamas fluorescenciniu zondu ir stebimas konfokaliniu mikroskopu. Galima ne tik stebėti įvairias fiksuotas ląsteles ir audinių struktūras, bet ir kokybiškai bei kiekybiškai stebėti ir reguliariai matuoti gyvų ląstelių morfologiją, struktūrą, jonus.
