Mikroorganizmų skaičiaus nustatymas – tiesioginis mikroskopo skaičiavimo metodas!
Bakterijų populiacijos augimas pasireiškia ląstelių skaičiaus padidėjimu arba ląstelių masės padidėjimu. Ląstelių skaičiaus nustatymo metodai apima tiesioginio mikroskopinio skaičiavimo metodą, plokštelių kolonijų skaičiavimo metodą, fotoelektrinės alyvos santykio metodą, didžiausios tikimybės metodą ir membraninio filtravimo metodą. Ląstelių medžiagos matavimo metodai apima ląstelių sausosios masės nustatymą, tam tikrų ląstelių komponentų, pvz., azoto, RNR ir DNR kiekio, bei metabolitų nustatymą. Trumpai tariant, yra daug mikroorganizmų augimo matavimo metodų, kurių kiekvienas turi savų privalumų ir trūkumų, todėl juos reikėtų parinkti pagal konkrečią situaciją. Šiame eksperimente daugiausia pristatomas tiesioginio skaičiavimo mikroskopu metodas, dažniausiai naudojamas gamyboje ir moksliniuose tyrimuose.
1. Tikslo reikalavimai
1. Išsiaiškinkite kraujo ląstelių skaičiaus nustatymo principą.
2. Įvaldyti mikroorganizmų skaičiavimo metodą naudojant kraujo ląstelių skaitiklį.
2. Pagrindiniai principai
Tiesioginio skaičiavimo mikroskopu metodas yra paprastas, greitas ir intuityvus būdas tiesiogiai suskaičiuoti nedidelį mėginio suspensijos kiekį, kuris bus tiriamas ant specialaus tam tikro ploto ir tūrio stiklelio (taip pat žinomas kaip bakterijų skaitiklis). Metodai. Šiuo metu namuose ir užsienyje dažniausiai naudojami bakterijų skaitikliai: kraujo ląstelių skaičiavimo lenta, Peteroff-Hauser bakterijų skaitiklis ir Hawksley bakterijų skaitiklis ir kt. Jie gali būti naudojami mielių, bakterijų, pelėsių sporų ir kitų suspensijų skaičiavimui, pagrindinis principas yra tas pats. Pastarųjų dviejų tipų bakterijų skaitiklių bendras tūris yra 0.02 mm3 uždengus dengiamuoju stiklu, o atstumas tarp dengiamojo stiklo ir stiklelio yra tik 0,02 mm, todėl alyva imersinis objektyvas gali būti naudojamas stebėti ir stebėti mažas ląsteles, tokias kaip bakterijos. skaičiuoti. Be šių bakteriometrų, taip pat yra tepinėlio ploto ir tiesiai po mikroskopu stebimo regėjimo lauko ploto santykio įvertinimo metodas, kuris dažniausiai naudojamas pieno bakteriologiniam tyrimui. Tiesioginio mikroskopo skaičiavimo metodo privalumai yra intuityvūs, greiti ir lengvai valdomi. Tačiau šio metodo trūkumas yra tas, kad išmatuotas rezultatas dažniausiai yra negyvų ir gyvų ląstelių suma. Šiuo metu yra keletas būdų, kaip pašalinti šį trūkumą, pavyzdžiui, gyvybingų bakterijų dažymo mikrokamerinės kultūros derinys (trumpą laiką) ir ląstelių dalijimosi inhibitorių pridėjimas, kad būtų pasiektas tikslas skaičiuoti tik gyvybingas bakterijas.
Šiame eksperimente hemocitometras buvo naudojamas kaip tiesioginio mikroskopinio skaičiavimo pavyzdys. Apie kitų dviejų tipų bakterijų skaitiklių naudojimą skaitykite kiekvieno gamintojo instrukcijose. Skaičiavimas tiesiai po mikroskopu su hemocitometru yra dažniausiai naudojamas mikroorganizmų skaičiavimo metodas. Skaičiavimo plokštelė yra speciali stiklinė stiklinė, ant kurios keturiomis plyšėmis suformuotos trys platformos; platesnė platforma viduryje per trumpą skersinį plyšį padalinta į dvi dalis, o kiekvienoje platformos pusėje yra tinklelis. Kiekvienas tinklelis yra padalintas į devynis didelius kvadratus, o didelis kvadratas viduryje yra skaičiavimo kambarys. Kraujo ląstelių skaičiavimo plokštelės struktūra parodyta l{{{{10}}}} paveiksle. Skaičiavimo kambario mastelis paprastai turi dvi specifikacijas: vienas yra didelis kvadratas, padalintas į 25 vidurinius kvadratus, o kiekvienas vidurinis kvadratas yra padalintas į 16 mažų kvadratų (15-2 pav.); kita – didelė aikštė. Kvadratas yra padalintas į 16 vidurinių kvadratų, o kiekvienas vidurinis kvadratas yra padalintas į 25 mažus langelius, bet nesvarbu, kokia tai skaičiavimo lenta, kiekviename dideliame kvadrate yra 400 mažų kvadratų. Kiekvieno didelio kvadrato kraštinės ilgis yra 1 mm, o kiekvieno didelio kvadrato plotas yra 1 mm2. Uždengus dengiamuoju stiklu, aukštis tarp dengiamojo stiklo ir stiklelio yra 0,1 mm, taigi skaičiavimo kameros tūris yra 0, lmm3 (viena tūkstantoji mililitro dalis). Paveikslas 15-1 Kraujo ląstelių skaičiavimo lentos struktūra (1) Paveikslas 15-2 Kraujo ląstelių skaičiavimo lentos struktūra (2) A. Vaizdas iš priekio; B. Išilginis pjūvio vaizdas; Padidintas tinklelis, didelis kvadratas viduryje yra skaičiavimo kamera 1. Kraujo ląstelių skaičiavimo plokštelė; 2. Dangtis stiklas; 3. Skaičiuodami skaičiavimo kameroje, paprastai suskaičiuokite bendrą bakterijų skaičių penkiuose kvadratuose, tada apskaičiuokite kiekvieno kvadrato vidurkį ir padauginkite iš 25 arba 16, kad gautumėte. Tada bendras bakterijų skaičius dideliame kvadrate paverčiamas bendras bakterijų skaičius 1 ml bakterijų tirpalo. Tegul bendras bakterijų skaičius penkiuose kvadratuose yra A, o bakterijų tirpalo praskiedimo santykis yra B. Jei tai yra skaičiavimo plokštelė su 25 kvadratais, bendras bakterijų skaičius 1 ml bakterijų tirpalo {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(gabalai) Panašiai, jei tai skaičiavimo plokštelė su 16 vidutinių kvadratų, bendras bakterijų skaičius 1 ml bakterijų tirpalo=A/ 5×16×104×B=32000A·B (gabalais)
3. Įranga
1. Bakterijos
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumentai ar kiti indai
Hemocitometras, mikroskopas, dengiantis stiklelis, sterilus kapiliarinis lašintuvas.
4. Veikimo žingsniai
1. Bakterijų suspensijos paruošimas
Saccharomyces cerevisiae buvo paruošta į tinkamos koncentracijos bakterijų suspensiją su steriliu fiziologiniu tirpalu.
2. Mikroskopo skaičiavimo kambarys
Prieš įdėdami mėginius, mikroskopu apžiūrėkite skaičiavimo plokštelės skaičiavimo kamerą. Jei yra nešvarumų, prieš skaičiuojant jį reikia nuvalyti ir išdžiovinti.
3. Pridėkite pavyzdį
Uždenkite švarų ir sausą hemocitometrą dengiamuoju stikleliu, o po to steriliu kapiliariniu lašintuvu nulašinkite nedidelį lašelį suplaktos Saccharomyces cerevisiae suspensijos nuo dengiamojo stiklelio krašto ir leiskite bakterijų tirpalui automatiškai judėti per tarpą kapiliarinio osmoso būdu. Įėjus į skaičiavimo patalpą, bendroji skaičiavimo patalpa gali būti užpildyta bakteriniu skysčiu. Imdami mėginius, pirmiausia suplakite bakterijų tirpalą; pridedant mėginius, skaičiavimo kameroje neturėtų susidaryti oro burbuliukų.
4. Skaičiavimas mikroskopu
Įdėjus mėginį, pastovėti 5 minutes, tada hemocitometrą padėti ant mikroskopo scenos, pirmiausia mažos galios mikroskopu rasti skaičiavimo kameros vietą, o tada skaičiavimui perjungti į didelės galios mikroskopą. Tinkamai sureguliuokite mikroskopo šviesos intensyvumą. Mikroskopams, kuriuose apšvietimui naudojami veidrodžiai, atkreipkite dėmesį, kad nenukryptumėte nuo vienos šviesos pusės, kitaip matymo lauke bus nelengva aiškiai matyti skaičiavimo kambario kvadratines linijas arba bus matomos tik vertikalios arba horizontalios linijos. būti matomas. Jei prieš skaičiuojant nustatoma, kad bakterijų tirpalas yra per koncentruotas arba per praskiestas, prieš skaičiuojant būtina iš naujo sureguliuoti praskiedimą. Paprastai mėginiui atskiesti kiekvienoje mažoje ląstelėje reikia apie 5–10 bakterijų. Kiekviena skaičiavimo kamera parenka 5 vidurines ląsteles (pasirinktinai 4 kampus ir vieną vidurinį langelį centre) skaičiavimui. Langeliai, esantys tinklelio linijoje, paprastai skaičiuojami tik viršutinėje ir dešinėje eilutėse. Mielių pumpurų atsiradimo atveju, kai pumpuro dydis pasiekia pusę motininės ląstelės, jis skaičiuojamas kaip dvi bakterijų ląstelės. Norėdami suskaičiuoti mėginį, apskaičiuokite bakterijų kiekį mėginyje, apskaičiuodami vidutinę vertę iš dviejų skaičiavimo kamerų.
5. Nuplaukite kraujo ląstelių skaičių
Po naudojimo kraujo ląstelių skaičiavimo lentą išskalaukite vandeniu iš čiaupo, nešveiskite kietais daiktais, o po plovimo išdžiovinkite patys arba plaukų džiovintuvu. Mikroskopinis tyrimas, siekiant nustatyti, ar kiekvienoje mažoje ląstelėje nėra likusių bakterijų ar kitų nuosėdų. Jei jis nėra švarus, jį reikia plauti kelis kartus, kol jis bus švarus.
