Pigių fluorescencinių ir šviesaus lauko mikroskopų projektavimas
1 žingsnis: Fluorescencinės mikroskopijos apžvalga
Norėdami suprasti pagrindines fluorescencinės mikroskopijos sąvokas, įsivaizduokite tankų mišką naktį, kuriame gyvena medžiai, gyvūnai, krūmai ir kiti miškai. Jei į mišką pašviesite žibintuvėlį, pamatysite visas šias struktūras ir sunku įsivaizduoti konkrečius gyvūnus ar augalus. Darant prielaidą, kad jus domina tik šilauogių krūmai miške. Norint tai pasiekti, ugniagesius reikia išmokyti, kad trauktų tik mėlynių krūmai, kad pažvelgus į mišką šviestų tik mėlynių krūmai. Galima sakyti, kad šilauogių krūmams žymėti naudojate ugniagesius, kad matytumėte šilauogių struktūrą miške.
Pagal šią analogiją miškai reprezentuoja visą pavyzdį, mėlynių krūmai – struktūras, kurias norite vizualizuoti (pvz., konkrečias ląsteles arba tarpląstelinius organelius), o ugniažolės yra fluorescenciniai junginiai. Situacija apšviesti vien šaulio žibintuvėlį be ugniagesių panaši į šviesaus lauko mikroskopą.
Kitas žingsnis – suprasti pagrindines fluorescencinių junginių (dar vadinamų fluoroforais) funkcijas. Fluorescenciniai klasteriai iš tikrųjų yra maži objektai (nano skalėje), skirti sujungti konkrečias mėginio struktūras. Jie sugeria siauro bangos ilgio diapazono šviesą ir vėl skleidžia kito bangos ilgio šviesą. Pavyzdžiui, fluoroforas gali sugerti mėlyną šviesą (ty fluoroforą sužadina mėlyna šviesa) ir vėl skleisti žalią šviesą. Paprastai tai apibendrinama sužadinimo ir emisijos spektrais (kaip parodyta aukščiau esančiame paveikslėlyje). Šiose diagramose rodomi fluoroforų sugertos šviesos bangos ilgiai ir fluoroforų skleidžiamos šviesos bangos ilgiai.
Mikroskopo konstrukcija labai panaši į įprastą šviesaus lauko mikroskopą, tačiau turi du pagrindinius skirtumus. Pirma, mėginį apšviečianti šviesa turi būti tokio bangos ilgio, kuris sužadina fluorescencinę grupę (anksčiau pateiktame pavyzdyje šviesa yra mėlyna). Antra, mikroskopui tereikia surinkti skleidžiamą šviesą (žalią šviesą), blokuojant mėlyną šviesą. Taip yra todėl, kad mėlyna šviesa yra visur, bet žalia šviesa sklinda tik iš konkrečių mėginio struktūrų. Norėdami blokuoti mėlyną šviesą, mikroskopai paprastai turi vadinamąjį ilgo pralaidumo filtrą, kuris leidžia žaliai šviesai prasiskverbti be mėlynos šviesos. Kiekvienas žemųjų dažnių filtras turi ribinį bangos ilgį. Jei šviesos bangos ilgis yra didesnis už ribinį bangos ilgį, ji gali praeiti per filtrą. Todėl pavadinimas yra „ilgo nuotolio leidimas“. Trumpesni bangos ilgiai blokuojami.
2 veiksmas: naudokite optinį modeliavimo mikroskopą
Tai papildomas žingsnis kuriant mikroskopus remiantis pagrindiniais principais. Nereikia kurti fluorescencinio mikroskopo, todėl jei nenorite gilintis į optiką, galite jo praleisti.
Tiek šviesaus lauko, tiek fluorescenciniai mikroskopai gali būti modeliuojami naudojant spindulių optikos prietaisus. Pagrindinė spindulinės optikos prielaida yra ta, kad šviesos elgesys yra panašus į šviesos, sklindančios nuo šviesos šaltinio. Apsidairę po kambarį, už lango pamatysite saulės šviesą arba lemputės atneštą šviesą. Tada šviesą sugeria arba atspindi patalpoje esantys objektai. Tam tikra atsispindėjusi šviesa nukreips ją į jūsų akis. Jei objektas yra apšviestas, galite įsivaizduoti, kad kiekvienas objekto taškas skleidžia šviesą visomis kryptimis (kaip parodyta paveikslėlyje aukščiau). Lęšis, kaip ir mūsų akių lęšis, fokusuoja šviesą į tašką, kad galėtume matyti objektus. Be objektyvo šviesa toliau sklinda į išorę ir nesudaro vaizdo.
