Ląstelių tyrimo mikroskopų klasifikavimas ir veikimas
Mikroskopas yra pagrindinis ląstelių stebėjimo įrankis. Pagal skirtingus šviesos šaltinius jį galima suskirstyti į dvi kategorijas: optinius mikroskopus ir elektroninius mikroskopus. Pirmasis naudoja matomą šviesą (UV mikroskopai naudoja ultravioletinę šviesą) kaip šviesos šaltinį, o antrasis naudoja elektronų pluoštus kaip šviesos šaltinį.
-, Optinis mikroskopas
(1) Paprastas optinis mikroskopas
Įprasti biologiniai mikroskopai susideda iš trijų dalių, būtent: ① apšvietimo sistemos, įskaitant šviesos šaltinį ir kondensatorių; ② optinio didinimo sistema, sudaryta iš objektyvo ir okuliaro, kuris yra pagrindinis mikroskopo korpusas. Siekiant pašalinti sferinę ir chromatinę aberaciją, okuliaras ir objektyvas ③ Mechaninis įtaisas, naudojamas medžiagai pritvirtinti ir stebėjimui palengvinti (2-1 pav.).
Ar mikroskopo vaizdas aiškus, lemia ne tik padidinimas, bet ir susijęs su mikroskopo raiška. Skiriamoji geba reiškia mikroskopo (arba žmogaus akies 25 cm atstumu nuo taikinio) gebėjimą atskirti mažiausią atstumą tarp objektų. Skiriamąją gebą lemia šviesos bangos ilgio ir diafragmos santykis bei terpės lūžio rodiklis išreiškiamas formule:
Formulėje: n=terpės lūžio rodiklis;=diafragmos kampas (mėginio atsidarymo kampas iki objektyvo lęšio diafragmos), NA=objektyvo diafragma (skaitinė diafragma). Objektyvo kampas visada yra mažesnis nei 180 laipsnių, todėl didžiausia sina/2 vertė turi būti mažesnė nei 1.
Stiklo, naudojamo optiniam lęšiui gaminti, lūžio rodiklis yra nuo 1,65 iki 1,78, o naudojamos terpės lūžio rodiklis yra arčiau stiklo, tuo geriau. Sausų objektyvų lęšiams terpė yra oras, o objektyvo diafragmos santykis paprastai yra 0.05–0,95; aliejiniams lęšiams kaip terpė naudojamas kedro aliejus, o objektyvo diafragmos santykis gali būti artimas 1,5.
Įprastos šviesos bangos ilgis yra {{0}}nm, todėl mikroskopo skiriamoji geba bus ne mažesnė kaip 0,2 μm, o žmogaus akies skiriamoji geba yra 0,2 mm, todėl maksimalus bendros mikroskopo konstrukcijos padidinimas paprastai yra 1000X.
(2) Fluorescencinė mikroskopija
Kai kurios ląstelėse esančios medžiagos, pavyzdžiui, chlorofilas, gali fluorescuoti po ultravioletinių spindulių apšvitinimo; kai kurios medžiagos pačios negali fluorescuoti, tačiau nudažytos fluorescenciniais dažais ar fluorescuojančiais antikūnais, gali fluorescuoti ir apšvitintos ultravioletiniais spinduliais, o fluorescencinis mikroskopas (pav. 2-2, 3, 4) yra vienas iš priemonių. kokybiniams ir kiekybiniams tokių medžiagų tyrimams.
Fluorescenciniai mikroskopai ir įprasti mikroskopai turi šiuos skirtumus:
1. Apšvietimo metodas dažniausiai yra epi-apšvietimas, tai yra, šviesos šaltinis projektuojamas ant mėginio per objektyvo lęšį (2-3 pav.);
2. Šviesos šaltinis yra ultravioletinė šviesa, bangos ilgis trumpesnis, o skiriamoji geba didesnė nei įprastų mikroskopų;
3. Yra du specialūs filtrai, priešais šviesos šaltinį esantis naudojamas matomai šviesai filtruoti, o esantis tarp okuliaro ir objektyvo – ultravioletiniams spinduliams filtruoti, siekiant apsaugoti akis.
(3) Lazerinis skenuojantis konfokalinis mikroskopas
Lazerinis konfokalinis skenuojantis mikroskopas (lazerinis konfokalinis skenuojantis mikroskopas, 2-5, 6 pav.) naudoja lazerį kaip skenuojamosios šviesos šaltinį ir nuskaito vaizdą taškas po taško, linija po linijos, paviršius po paviršiaus, o skenuojantis lazeris ir fluorescencinė kolekcija dalijasi objektyvo lęšis, o objektyvo židinys yra Skenuojančio lazerio židinio taškas taip pat yra momentinio vaizdo objekto taškas. Kadangi lazerio spindulio bangos ilgis yra trumpas, o spindulys labai plonas, konfokalinis lazerinis skenuojantis mikroskopas turi didesnę skiriamąją gebą, kuri yra maždaug 3 kartus didesnė nei įprasto optinio mikroskopo. Sistema sufokusuojama vieną kartą ir nuskaitoma tik viena mėginio plokštuma. Kai fokusavimo gylis yra skirtingas, galima gauti skirtingų mėginio gylio lygių vaizdus. Ši vaizdo informacija yra saugoma kompiuteryje. Atliekant kompiuterinę analizę ir modeliavimą, galima parodyti trimatę ląstelės mėginio struktūrą.
Konfokalinė lazerinė skenuojanti mikroskopija gali būti naudojama ne tik ląstelių morfologijai stebėti, bet ir kiekybinei intraląstelinių biocheminių komponentų analizei, optinio tankio statistikai bei ląstelių morfologijos matavimui.
(4) Tamsaus lauko mikroskopas
Tamsaus lauko mikroskopas (tamsiojo lauko mikroskopas, 2-7 pav.) turi šviesos lakštą kondensatoriaus centre, kad apšvietimo šviesa nepatektų tiesiai į žmogaus lęšį, o tik mėginio atspindėta ir išsklaidyta šviesa. leidžiama patekti į objektyvo lęšį, todėl matymo lauko fonas yra juodas, Objektų kraštai yra šviesūs. Naudojant šį mikroskopą, matomos iki 4-200nm dydžio dalelės, o skiriamoji geba gali būti 50 kartų didesnė nei įprastų mikroskopų.
(5) Fazinio kontrasto mikroskopas
P. Zernike fazikontrastinis mikroskopas (fazikontrasto mikroskopas, 2-8, 9 pav.) buvo išrastas 1932 m. ir už jį 1953 m. laimėjo Nobelio fizikos premiją. Didžiausia šio mikroskopo savybė yra ta, kad juo galima stebėti nedažytus mėginius ir gyvas ląsteles.
Pagrindinis fazinio kontrasto mikroskopijos principas yra pakeisti pro bandinį praeinančios matomos šviesos optinio kelio skirtumą į amplitudės skirtumą, taip pagerinant kontrastą tarp įvairių struktūrų ir padarant įvairias struktūras aiškiai matomas. Praleidus bandinį, šviesa lūžta, nukrypsta nuo pradinio optinio kelio ir vėluojama 1/4λ (bangos ilgis). Stiprinkite, padidinkite arba sumažinkite amplitudę, padidinkite kontrastą. Kalbant apie struktūrą, fazinio kontrasto mikroskopai turi dvi specialias savybes, kurios skiriasi nuo įprastų optinių mikroskopų:
1. Žiedinė diafragma yra tarp šviesos šaltinio ir kondensatoriaus, o jos funkcija yra padaryti, kad šviesa, einanti per kondensatorių, sudarytų tuščiavidurį šviesos kūgį ir sutelktų dėmesį į bandinį.
2. Fazinė plokštelė (žiedinė fazinė plokštelė) į objektyvo lęšį prideda fazinę plokštę, padengtą magnio fluoridu, kuri gali 1/4λ uždelsti tiesioginės šviesos arba difrakcinės šviesos fazę. Yra du tipai:
①A pliusinės fazės plokštė: tiesioginė šviesa vėluojama 1/4λ. Sujungus dvi šviesos bangų grupes, šviesos bangos sudedamos ir amplitudė padidinama. Mėginio struktūra yra ryškesnė nei aplinkinė terpė, todėl susidaro ryškus kontrastas (arba neigiamas kontrastas).
② B plius fazinė plokštė: difrakcinė šviesa vėluojama 1/4λ. Sujungus du spindulių rinkinius, šviesos bangos atimamos, o amplitudė tampa mažesnė, susidaro tamsus kontrastas (arba teigiamas kontrastas), o struktūra yra tamsesnė nei aplinkinė terpė.
