Įvairių didelės skiriamosios gebos mikroskopijos metodų palyginimas
Atliekant įprastą šviesos mikroskopiją, šviesos difrakcija riboja vaizdo skiriamąją gebą iki maždaug 250 nm. Šiandien didelės skiriamosios gebos metodai gali tai pagerinti daugiau nei 10 kartų. Ši technika daugiausia pasiekiama trimis metodais: vienos molekulės lokalizacijos mikroskopija, įskaitant šviesai jautrią lokalizacijos mikroskopiją (PALM) ir stochastinę optinės rekonstrukcijos mikroskopiją (STORM); struktūrinio apšvietimo mikroskopija (SIM); ir stimuliuojamos emisijos mažėjimo mikroskopija (STED). Visiems rūpi, kaip pasirinkti itin didelės raiškos technologiją. „Deja, nėra paprastų principų, kaip nuspręsti, kurį metodą naudoti“, – sako Mathew Stracy, Oksfordo universiteto (JK) doktorantas. „Kiekvienas turi savų privalumų ir trūkumų“. Žinoma, mokslininkai taip pat aiškinasi, kaip pasirinkti tinkamą metodą konkrečiam projektui. "Biologinio vaizdo gavimo kontekste pagrindiniai veiksniai, į kuriuos reikia atsižvelgti, yra šie: erdvinė ir laiko skiriamoji geba, jautrumas fotopažeidimams, ženklinimo pajėgumas, mėginio storis ir fono fluorescencija arba ląstelių autologinė fluorescencija." Kaip tai veikia Įvairūs didelės raiškos mikroskopai veikia skirtingai. PALM ir STORM atveju tam tikru momentu sužadinama arba fotoaktyvuojama tik nedidelė fluorescencinių žymenų dalis, leidžianti jų nepriklausomą lokalizaciją labai tiksliai. Atlikus šį procesą su visomis fluorescencinėmis etiketėmis, gaunamas visiškas itin didelės raiškos vaizdas. Stefanas Hellas, vienas iš 2014 m. Nobelio chemijos premijos laureatų ir Maxo Plancko biofizinės chemijos instituto direktorius, sakė: „PALM/STORM sistemą palyginti lengva nustatyti, tačiau ją sunku pritaikyti, nes fluorescencinė lemputė grupė turi turėti fotoaktyvacijos gebėjimą. Apribojimai Trūkumas yra tas, kad jie turi aptikti vieną fluorescencinę molekulę ląstelės kontekste ir yra mažiau patikimi nei STED." STED naudoja lazerio impulsą fluoroforui sužadinti ir žiedo formos lazerį fluoroforui užgesinti, paliekant tik tarpinę nanometro dydžio fluorescenciją, kad būtų užtikrinta puiki raiška. Nuskenavus visą pavyzdį gaunamas vaizdas. „STED pranašumas yra tas, kad tai yra mygtukų technologija“, – paaiškino Hell. "Jis veikia kaip standartinis konfokalinis fluorescencinis mikroskopas." Jis taip pat gali vaizduoti gyvas ląsteles naudojant fluoroforus, tokius kaip žalios arba geltonos spalvos fluorescenciniai baltymai ir rodamino kilmės dažikliai. Parametrų palyginimas Nors visi didelės skiriamosios gebos metodai raiška lenkia įprastą šviesos mikroskopiją, jie skiriasi vienas nuo kito. SIM apytiksliai padvigubina skiriamąją gebą iki maždaug 100 nm. PALM ir STORM gali išspręsti 15 nm taikinius. Pasak pragaro, STED suteikia 30 nm erdvinę skiriamąją gebą gyvose ląstelėse ir 15 nm fiksuotose ląstelėse. Kalbant apie konkrečias programas, taip pat turime atsižvelgti į signalo ir triukšmo santykį. Kai kuriais atvejais mažesnė skiriamoji geba, bet didesnis SNR gali lemti geresnį vaizdą nei priešingas (didesnė skiriamoji geba, bet mažesnis SNR). Vaizdo gavimo greitis taip pat labai svarbus, ypač gyvoms ląstelėms. „Visi didelės skiriamosios gebos metodai yra lėtesni nei įprasti fluorescencinio vaizdo gavimo metodai“, - sakė Stracy. „PALM/STORM yra lėčiausias, norint gauti vieną vaizdą reikia dešimčių tūkstančių kadrų, SIM reikia dešimčių kadrų, o STED yra nuskaitymo technologija, todėl gavimo greitis priklauso nuo matymo lauko dydžio. Be gyvų ląstelių ar fiksuotų vaizdo gavimo ląstelių, kai kurie mokslininkai taip pat nori suprasti, kaip juda objektai. Stracy domisi gyvų ląstelių biologinių sistemų dinamika, o ne tik statiniais vaizdais. Jis sujungia PALM su vienos dalelės sekimu, kad analizuotų gyvų ląstelių dinamiką. Tokiu būdu jis gali tiesiogiai sekti žymenų molekules, kai jos atlieka savo funkcijas. Tačiau jis mano, kad SIM nėra tinkamas šiems dinaminiams procesams tirti molekuliniu lygmeniu, tačiau dėl greito gavimo greičio ypač tinka didesnių struktūrų, pavyzdžiui, ištisų chromosomų, dinamikai stebėti. Naujausi rezultatai 2017 m. pragaro komanda paskelbė apie MINFLUX itin didelės raiškos mikroskopą mokslo žurnale. Anot Pragaro, šis itin didelės raiškos metodas pirmą kartą pasiekia 1 nm erdvinę skiriamąją gebą. Be to, jis gali sekti atskiras molekules gyvose ląstelėse bent 100 kartų greičiau nei kitais metodais. Kiti mokslininkai taip pat gerai kalbėjo apie MINFLUX mikroskopą. „Nuolat kuriamos naujos programos ir požiūriai, tačiau man atrodo du pasiekimai“, – sakė Shechtmanas. Vienas iš jų yra MINFLUX. "Jis naudoja išradingą metodą labai tiksliam molekulinės padėties nustatymui." Kalbėdamas apie antrą įdomų vystymąsi, Shechtman paminėjo WE Moernerį ir jo kolegas iš Stanfordo universiteto. Moerneris taip pat buvo 2014 m. Nobelio chemijos premijos laureatas. Vienas iš laimėtojų. Norėdami išspręsti vaizdo skiriamosios gebos apribojimą, kurį sukelia anizotropinis fluorescencinių atskirų molekulių sklaida, mokslininkai naudojo skirtingas sužadinimo poliarizacijas, kad nustatytų molekulių orientaciją ir padėtį. Be to, jie turi subtilų vyzdžių paviršių. Šie metodai pagerina gebėjimą lokalizuoti struktūras. Apie fluorescencines etiketes Daugelyje itin didelės raiškos programų etiketės yra tikrai svarbios. Taip pat yra įmonių, kurios tiekia susijusius produktus. Pavyzdžiui, Vokietijos „Miltenyi“ susivienijo su Stefano Hello įkurta įmone „Abberior“, kad teiktų individualias antikūnų konjugavimo paslaugas, skirtas ypač didelės skiriamosios gebos mikroskopiniams dažams. Nemažai kitų įmonių taip pat siūlo atitinkamus žymeklius. „Mūsų nanostiprintuvai yra labai maži, tik 1,5 kDa ir labai specifiniai“, – sako Christophas Eckertas, „ChromoTek“ rinkodaros pareigūnas. Šie baltymai jungiasi su žalios ir raudonos spalvos fluorescenciniais baltymais (GFP ir RFP). Jie gaunami iš alpakų antikūnų fragmentų, žinomų kaip VHH arba nanokūnai, pasižymintys puikiomis surišimo savybėmis ir stabilia kokybe, be partijų skirtumų. Šie žymekliai tinka įvairioms didelės raiškos technikoms, įskaitant SIM, PALM, STORM ir STED. Merilendo universiteto medicinos mokyklos docentas Ai-Hui Tang ir jo kolegos naudojo ChromoTek GFP-Booster ir STORM, kad ištirtų informacijos sklaidą nervų sistemoje. Presinapsiniuose ir postsinaptiniuose neuronuose jie aptiko molekulinių nanoklasterių, vadinamų nanokolonelėmis. Mokslininkai mano, kad ši struktūra rodo, kad centrinė nervų sistema naudoja paprastus principus sinapsiniam efektyvumui palaikyti ir reguliuoti. Įvairios didelės skiriamosios gebos vaizdavimo versijos ir vis daugiau metodų mokslininkus įveda į biologines paslaptis dar giliau. Peržengę matomos šviesos difrakcijos ribą, biologai gali netgi „atidžiai stebėti“ ląstelių veiksmus.
