Dviejų fotonų fluorescencinio mikroskopo techninės charakteristikos ir naudojimo įgūdžiai
Dviejų fotonų fluorescencinė mikroskopija yra nauja technologija, sujungianti lazerinę skenuojančią konfokalinę mikroskopiją ir dviejų fotonų sužadinimo technologiją.
Pagrindinis dviejų fotonų sužadinimo principas yra toks: esant dideliam fotonų tankiui, fluorescencinės molekulės gali vienu metu sugerti du ilgos bangos fotonus, o po trumpo vadinamojo sužadintos būsenos gyvavimo laiko išspinduliuoti trumpesnės bangos fotoną. . ; Poveikis yra toks pat, kaip naudojant fotoną, kurio bangos ilgis yra pusė ilgosios bangos ilgio, kad sužadintų fluorescencinę molekulę. Dviejų fotonų sužadinimui reikalingas didelis fotonų tankis. Kad nebūtų pažeistos ląstelės, dviejų fotonų mikroskopijoje naudojami didelės energijos režimu blokuojami impulsiniai lazeriai. Šio lazerio skleidžiamas lazeris turi didelę didžiausią energiją ir mažą vidutinę energiją, jo impulso plotis siekia tik 100 femtosekundžių, o jo periodas gali siekti 80–100 megahercų. Naudojant didelės skaitinės diafragmos objektyvą impulsinio lazerio fotonams sufokusuoti, fotonų tankis objektyvo židinio taške yra didžiausias, o dviejų fotonų sužadinimas vyksta tik objektyvo židinio taške, todėl dviejų fotonų mikroskopui nereikia konfokalinės skylutės, o tai pagerina fluorescencijos aptikimo efektyvumą. Tai svarbus tyrimo metodas morfologijos, molekulinių ląstelių biologijos, neurologijos ir farmakologijos srityse.
1. Dviejų fotonų mikroskopijos atsiradimo fonas – du tradicinės lazerinės konfokalinės mikroskopijos apribojimai:
1) Vienas iš jų yra fototoksiškumo reiškinys: kadangi konfokalinė skylutė turi būti pakankamai maža, kad būtų gautas didelės raiškos vaizdas, o maža diafragma blokuos didelę mėginio skleidžiamos fluorescencijos dalį, įskaitant fluorescenciją, skleidžiamą iš židinio plokštumos, atitinkama Taip, sužadinimo šviesa turi būti pakankamai stipri, kad būtų pasiektas pakankamas signalo ir triukšmo santykis; o dėl didelio intensyvumo lazerio nenutrūkstamo skenavimo metu fluorescenciniai dažai greitai išnyks, o fluorescencinis signalas nuskaitymo eigoje vis silpnės.
2) Fototoksiškumas yra kita problema. Švitinant lazeriu, daugelis fluorescencinių dažų molekulių gamins citotoksinus, tokius kaip vienetinis deguonis arba laisvieji radikalai, todėl eksperimento metu reikia apriboti skenavimo laiką ir sužadinimo šviesos optinės galios tankį, kad būtų išlaikytas mėginio tankis. aktyvus. Tiriant aktyvius mėginius, ypač įvairias aktyvių mėginių augimo ir vystymosi stadijas, fotobalinimas ir fototoksiškumas daro šiuos tyrimus labai ribotus.
2. Kodėl sakote, kad dviejų fotonų mikroskopuose paprastai nereikia turėti ultravioletinių sužadinimo lazerių?
Dviejų fotonų mikroskopija yra fluorescencinio sužadinimo technologija, pagrįsta dviejų fotonų sužadinimo efektu: fluorescencinių dažų molekulės gali būti sužadinamos vienu metu sugeriant du mažos energijos fotonus (laiko intervalas tarp dviejų fotonų, pasiekiančių fluorescencines molekules, yra mažesnis nei 1 femtosekundė ), jo sužadinimo efektas gali prilygti didelės energijos, 1/2 bangos ilgio fotono absorbavimui. Pavyzdžiui, dviejų fotonų sugertis esant raudonam bangos ilgiui prilygsta molekulei, sugeriančiai ultravioletinius spindulius. Ląstelės nelengvai sugeria ilgos bangos fotonus, todėl sumažėja fototoksiškumas gyvoms ląstelėms, taip pat sumažėja fotobalinimas. Tokiu būdu jis ne tik atlieka ultravioletinių spindulių sužadinimo funkciją, bet ir išvengia ultravioletinių spindulių žalos mėginiui.
3. Kuo ypatingas dviejų fotonų mikroskopo lazeris?
Dviejų fotonų sugerties tikimybė priklauso nuo to, kaip artimai sutampa du krintantys fotonai erdvėje ir laike (du fotonai turi atvykti per 10-18 sek.). Dviejų fotonų sugerties skerspjūvis yra mažas ir sužadinami tik fluoroforai regionuose, kuriuose yra didelis fotonų srautas. Todėl dauguma naudojamų lazerių yra titano safyro lazeriai, kurie gali pasiekti pikosekundžių arba femtosekundžių skenavimo greitį, turi labai didelę didžiausią galią ir mažą vidutinę galią, kad būtų galima sumažinti arba visiškai pašalinti fotobalinimą ir fototoksiškumą. Svarbiausia yra užtikrinti labai didelį fotonų tankį mažame diapazone, kuris gali užtikrinti dviejų fotonų sužadinimą vienu metu.
4. Kokie yra dviejų fotonų sužadinimo privalumai?
1) Padidinkite dažų selektyvumą: konfokalinės sistemos lazerio (Ar, Ar/Kr, HeNe) sužadinimo šviesos diapazonas yra 488nm - 647nm. Tai reiškia, kad reikia eksperimentuoti su UV sužadintais fluorescenciniais dažais, pvz., su DAPI , Hoescht. Dviejų fotonų sužadinimo bangos ilgis yra du kartus didesnis nei vieno fotono, todėl dažai, sužadinti ultravioletiniais spinduliais, gali būti sužadinti artimos infraraudonosios šviesos.
2) Sumažinti fotobalinimą: dėl sumažėjusio fotobalinimo, eksperimentų, naudojant CFP/YFP fluorescencinio rezonanso energijos perdavimui (FRET) sėkmės rodiklis padidėja.
3) Specialių objektyvų nereikia: aparatūros požiūriu UV sužadintų dažų sužadinimui artimos infraraudonosios šviesos bangos ilgiu nereikia specialių UV optinių komponentų.
4) Pagerinkite signalo ir triukšmo santykį: sužadinimo šviesos bangos ilgis ir skleidžiamos šviesos bangos ilgis turi didelį skirtumą, o tai pagerina signalo ir triukšmo santykį.
5) Balinimas, lokalizuotas židinio taške: kadangi fluorescencinis sužadinimas vyksta tik objektyvo židinio taške, konfokalinės skylutės nereikia. Tai pagerina šviesos aptikimą ir fotobalinimas atsiranda tik židinio taške.
6) Lengviau prasiskverbti į mėginius: infraraudonųjų spindulių bangos ilgio šviesa nėra lengvai išsklaidoma ląstelių ir gali prasiskverbti į gilesnius mėginius.
5. Koks didžiausias dviejų fotonų mikroskopijos patobulinimas, palyginti su lazeriu skenuojančia konfokaline mikroskopija?
1) Sumažėjęs fotobalinimas.
2) Sumažintas fototoksiškumas.
3) Išsklaidyti nėra lengva ir lengviau prasiskverbti į storus mėginius, tokius kaip smegenų griežinėliai.
