Konfokalinės mikroskopijos principai
Konfokalinis mikroskopas yra didelio tikslumo vaizdo gavimo instrumentas, atsiradęs ir sukurtas devintajame dešimtmetyje, ir yra esminis mokslinių tyrimų instrumentas tiriant submikronines struktūras. Tobulėjant kompiuteriams, vaizdo apdorojimo programinei įrangai ir lazeriams, konfokaliniai mikroskopai taip pat labai tobulėjo ir dabar yra plačiai naudojami biologijos, mikrosistemų ir medžiagų matavimo srityse. Konfokalinis mikroskopas yra naujo tipo mikroskopas, kuriame integruotas konfokalinis principas, skenavimo technologija ir kompiuterinės grafikos apdorojimo technologija. Pagrindiniai jo pranašumai yra šie: didelė šoninė skiriamoji geba ir didelė ašinė skiriamoji geba bei efektyvus išsklaidytos šviesos slopinimas su dideliu kontrastu.
Įprasta konfokalinio mikroskopo sąranka yra dvi mažos skylės, kurių viena yra priešais šviesos šaltinį, o kita prieš detektorių, kaip parodyta paveikslėlyje. 1. Iš paveikslo matyti, kad kai išmatuotas mėginys yra kvazifokusavimo plokštumoje, aptikimo galo surenkamas šviesos intensyvumas yra didžiausias; kai išmatuotas mėginys yra nefokusuotoje padėtyje, šviesos dėmė aptikimo gale išsisklaido ir šviesos intensyvumas greitai mažėja. Todėl tik židinio plokštumos taškų skleidžiama šviesa gali prasiskverbti pro išėjimo angą, o už židinio plokštumos esančių taškų skleidžiama šviesa yra defokusuojama į išėjimo angos plokštumą, o dauguma jų negali praeiti pro centrinę skylę. Todėl židinio plokštumos stebėjimo tikslinis taškas atrodo šviesus, o ne stebėjimo taškas atrodo juodas kaip fonas, padidinantis kontrastą ir išvalantis vaizdą. Vaizdo gavimo proceso metu dvi skylutės yra konfokalinės, konfokalinis taškas yra aptiktas taškas, o plokštuma, kurioje yra aptiktas taškas, yra konfokalinė plokštuma.
Konfokalinės mikroskopijos metu detektoriaus skylutės dydis vaidina lemiamą vaidmenį. Tai tiesiogiai veikia sistemos skiriamąją gebą ir signalo ir triukšmo santykį. Jei skylutė yra per didelė, konfokalinio aptikimo efektas nebus pasiektas, o tai ne tik sumažina sistemos skiriamąją gebą, bet ir įveda daugiau išsklaidytos šviesos; jei skylutė per maža, tai sumažins aptikimo efektyvumą ir sumažins mikroskopinį vaizdą. ryškumas. Tyrimai parodė, kad kai skylutės skersmuo yra lygus Airy disko skersmeniui, tenkinami konfokaliniai reikalavimai, o aptikimo efektyvumas labai nesumažėja. Kadangi skylutės skersmuo paprastai yra mikronų eilės, jei yra nuokrypis tarp lazerio spindulio židinio taško ir skylutės padėties, atsiranda signalo iškraipymas. Todėl konfokaliniuose mikroskopuose paprastai naudojama automatinio fokusavimo sistema, kuri iš esmės padidina matavimo laiką.
Kadangi lazerinis konfokalinis skenavimo mikroskopas yra taškinis vaizdavimas, norint gauti dvimatį objekto vaizdą, būtina naudoti dvimatį skenavimą x ir y kryptimis. Skirtinguose mikroskopuose naudojami skirtingi nuskaitymo metodai:
(1) Objektų nuskaitymas. Tai yra, pats objektas juda pagal tam tikrą dėsnį, o šviesos spindulys išlieka nepakitęs. Privalumai: stabilus optinis kelias; Trūkumai: reikalinga didelė nuskaitymo lentelė, todėl nuskaitymo greitis yra labai ribotas.
(2) Spindulio skenavimo sistema formuojama naudojant atspindintį galvanometrą. Tai yra, valdant nuskaitymo galvanometrą, sufokusuotas šviesos taškas reguliariai atsispindi tam tikrame objekto sluoksnyje, kad būtų užbaigtas dvimatis nuskaitymas. Jo pranašumas yra tai, kad jis turi didelį tikslumą ir dažnai naudojamas didelio tikslumo matavimams. Nuskaitymo greitis pagerėjo, palyginti su objektų nuskaitymu, tačiau jis vis dar nėra greitas.
(3) Nuskaitymui naudokite akusto-optinį nukreipimo elementą, o nuskaitymas atliekamas keičiant garso bangos išėjimo dažnį ir keičiant šviesos bangos perdavimo kryptį. Jo išskirtinis pranašumas yra labai greitas nuskaitymo greitis. Jungtinių Valstijų sukurta skenavimo sistema naudoja akustinį-optinį deflektorių, kad generuotų vaizdo vaizdus realiuoju laiku. Dvimačio vaizdo nuskaitymas užtrunka tik 1/30 s, o išvestis beveik pasiekiama realiuoju laiku.
(4) Nipkow disko nuskaitymas. Nuskaitymo procesas baigiamas sukant Nipkow diską, o kitus komponentus nejudinant. Jis gali būti vaizduojamas vienu metu, o greitis yra labai didelis. Tačiau kadangi vaizdo spindulys yra ne ašies šviesa, objektyvo ne ašies aberacija turi būti ištaisyta, o šviesos energijos panaudojimo greitis yra labai mažas.
