Daugiafotonų mikroskopijos vaizdo gavimo technologija: poliarizacijos-išspręstos antrosios-harmoninės kartos mikroskopija ir jos vaizdo apdorojimas
Netiesiniuose optiniuose mikroskopuose endogeninėms pluoštinėms struktūroms stebėti dažniausiai naudojamas antrosios harmoninės kartos (SHG) vaizdavimas, o SHG intensyvumas labai priklauso nuo santykinio kampo tarp krintančio pluošto poliarizacijos krypties ir tikslinės molekulės orientacijos ašies. Todėl poliarizacija pagrįstas SHG vaizdavimas (P-SHG) gali gauti struktūrinę informaciją apie tikslines molekules, analizuodamas funkcinį ryšį tarp SHG signalo intensyvumo ir krentančio pluošto poliarizacijos būsenos. Dabar jis naudojamas kaip svarbi medicininės ir biologinės analizės priemonė.
Paprastus SHG vaizdus galima gauti naudojant tradicinę dviejų{0}}fotonų sužadinimo fluorescencinę mikroskopiją (TPM). Dauguma TPM sistemų vis dar naudoja vieno spindulio skenavimo metodą, pagrįstą judančiu veidrodžiu, kurio laiko skiriamoji geba priklauso nuo veidrodžio fizinio judėjimo greičio. Kad vaizdas būtų greitesnis, TPM sistema taip pat gali pritaikyti kelių spindulių nuskaitymo metodą (1A pav.), vienas iš kurių yra naudoti besisukančio disko nuskaitymo įrenginį. Šį įrenginį sudaro bendraašis mikroobjektyvo patefonas ir patefonas, kurio mikro lęšiai ir skylutės ant kiekvieno patefono atitinka vieną-prie-vieną.
Kai lazeris praeina per mikro lęšių patefonas, bangos frontas uždengia kelis mikro lęšius. Skirtingi mikro lęšiai sufokusuoja skirtingas bangos fronto dalis į skirtingas pozicijas ir praeina pro atitinkamas skylutes, sudarydami daugybę mikro spindulių. Šie mikro spinduliai, patekę į mėginį, gali vienu metu sužadinti kelis signalus. Šie signalai grįžta išilgai mikroskopo sistemos ir vėl praeina pro skylutę, o galiausiai atsispindi dichroiniame veidrodyje tarp dviejų patefonų į aptikimo įrenginį. Tačiau dažniausiai naudojamas titano safyro lazeris, kaip šviesos šaltinis, neturi pakankamai energijos, o tai riboja sužadinimo spindulių skaičių ir sukuria mažą efektyvų TPM (TPM-SD) matymo lauką (TPM{5}}SD), naudojant sukamąjį nuskaitymo įrenginį.
Ai Goto ir kt. Siekta pasiekti didelės-greitos P-SHG su dideliu matymo lauku (FOV), naudojant TPM-SD sistemą. Todėl į TPM-SD sistemą buvo įtrauktas Yb pagrįstas lazerio šaltinis su didesne didžiausia galia.
Tai yra jų sukurtos TPM{0}}SD sistemos schema. Sistemos šviesos šaltinis yra Yb lazeris, generuojantis femtosekundžių impulsus, kurių centrinis bangos ilgis yra 1042 nm, vidutinė galia 4 W, impulso plotis 300 fs ir 10 MHz pasikartojimo dažnis. Sistema pirmiausia reguliuoja lazerio galią per pusės bangos plokštę ir Glan lazerinį poliarizatorių, o tada išplečia spindulį per pluošto plėtiklį. Išplėstas spindulys įvedamas į patefono nuskaitymo įrenginį, o keli mikro pluoštai, išeinantys iš nuskaitymo įrenginio, per panardinamąjį vandens objektyvą sufokusuojami į kelis mėginio taškus. Siekiant sureguliuoti šviesos pluošto poliarizacijos būseną ties objektyvo lęšiu, ant žadinimo pluošto optinio kelio dedama pusės bangos plokštė ir ketvirtadalio bangos plokštė.
