Kaip išsirinkti sau tinkamą konfokalinį mikroskopą? Ar yra koks nors konkretus metodas?
Konfokalinė mikroskopija turi daugiau privalumų nei plataus lauko mikroskopija. Konfokalinė mikroskopija gali atlikti nuolatinį optinį mėginių pjūvį ir pašalinti signalo trukdžius iš nežidinio plokštumų. Dėl šios priežasties konfokalinės mikroskopijos taikymas iš tiesų yra dažnesnis. Tačiau rinkoje atsiranda vis daugiau konfokalinių mikroskopų. Kaip išsirinkti?
Konfokalinė mikroskopija turi daugiau privalumų nei plataus lauko mikroskopija. Konfokalinė mikroskopija gali sudaryti ištisines optines mėginių dalis ir pašalinti signalo trukdžius iš nežidinio plokštumų. Dėl šios priežasties konfokalinė mikroskopija iš tiesų yra dažnesnė. Tačiau rinkoje atsiranda vis daugiau konfokalinių mikroskopų. Kaip išsirinkti? Renkantis konfokalinį mikroskopą, atsižvelgiama į du pagrindinius ir svarbius aspektus: norimo tirti mėginio tipą (pvz., fiksuotos arba gyvos ląstelės) ir norimo atlikti tyrimo tipą (pvz., statiniai arba dinaminiai ląstelių procesai).
Fiksuotų ląstelių konfokalinis vaizdas
Norėdami atvaizduoti fiksuotas ir nudažytas ląsteles ar audinius, dažniausiai pasirenkame konfokalinį lazerinį nuskaitymą (LSCM). Taip yra daugiausia todėl, kad fiksuotose negyvose ląstelėse trūksta greitų biologinių įvykių gyvose ląstelėse ir jos gali geriau pasinaudoti didesne LSCM erdvine skiriamąja geba. LSCM vaizdavimas yra optinis mėginio pjaustymas lazeriu, o nuskaitymo greitis (priklausomai nuo nuskaitymo matricos veidrodžio greičio) paprastai yra 1 kadras per sekundę. Ilgesnis ekspozicijos laikas reiškia didesnę fotobalinimo riziką, tačiau fiksuotoms negyvoms ląstelėms laikas nėra labai svarbus ir galime jį suvidurkinti darydami kelias nuotraukas.
Konfokalinis gyvų ląstelių vaizdas
Norint vaizduoti gyvas ląsteles, reikia papildomos apsaugos nuo nedraugiškos aplinkos. Atliekant vaizdus, pirmiausia turime išlaikyti ląstelių gyvybingumą ir sveikatą. Pastovios temperatūros kaitinimo elementai ir perfuzijos sistemos yra būtinos, ypač atliekant laiko intervalo tyrimus. Dauguma žmonių nori ištirti greitus biocheminius įvykius, kurie kontroliuoja gyvų ląstelių fiziologinę būklę, tačiau šie įvykiai yra per greiti įprastinei LSCM. Be to, ilgalaikis LSCM poveikis taip pat sukėlė toksišką šviesos pažeidimą ląstelėms. Todėl gyvų ląstelių vaizdavimui reikia specialių konfokalinių mikroskopų.
Paprastai yra dvi konfokalinio gyvų ląstelių vaizdavimo parinktys: greitas skenuojantis lazeriu skenuojantis konfokalinis ir besisukantis disko konfokalinis vaizdas. Greito skenavimo konfokalinė mikroskopija lėtesnius galvanometrų veidrodžius pakeičia greitesniais rezonansiniais nuskaitymo veidrodžiais, todėl nuskaitymo greitis siekia iki 30 kadrų per sekundę; Nors besisukančių diskų konfokaliai (SDCM) turi greitesnio nuskaitymo pranašumą (nors neišvengiamai prarandama erdvinė skiriamoji geba), jo greitis teoriškai gali siekti 2000 kadrų per sekundę (praktiškai jį dažnai riboja kiti veiksniai).
Jei nerimaujate dėl fotobalinimo arba labai silpno fluorescencinio signalo, SDCM gali būti tinkamesnis. SDCM naudoja du besisukančius diskus su išdėstytais mikrošulinėliais, kad išsklaidytų sužadinimo šviesą. Skirtingai nuo LSCM, kuris nuskaito mėginio tašką, SDCM vienu metu įgyja kelias dėmes (apie 100 pikselių dėmių), todėl sparta labai padidėja, SDCM fotobalinimas ir mažesnis fototoksiškumas. Tačiau taip pat galite naudoti greito nuskaitymo konfokalius, kad padidintumėte nuskaitymo greitį, kartu su labai jautriais detektoriais ir sumažintumėte sužadinimo šviesos energiją, kad sumažintumėte fototoksiškumą, kuris gali išlaikyti turtingas tradicinių konfokalių funkcijas.
Automatizuota konfokalinio vaizdo gavimo sistema
Kai kurie tyrinėtojai nori rasti būdų, kaip modifikuoti mikroskopą, kad jis atitiktų jų individualius poreikius. O kai kurių tyrinėtojų net nesidomi, kaip iš tikrųjų veikia mikroskopai. Pastariesiems gali labiau patikti automatinis konfokalinis mikroskopas. Pavyzdžiui, „Olympus FluoViewFV10i“ yra visiškai automatinis stalinis 4-lazerinis konfokalinis mikroskopas. Jo kompaktiška integruota konstrukcija beveik nereikalauja montavimo vietos. Šio tipo instrumentai idealiai tinka tyrėjams, kuriems kasdien reikia atlikti daug vaizdo duomenų rinkimo, tačiau, žinoma, jie nevisiškai atspindi tradicinių konfokalių funkcionalumą ir lankstumą. Be to, NikonA1 taip pat yra visiškai automatinė konfokalinė sistema. Kaip ir dauguma įprastų konfokalinio skenavimo mikroskopų, NikonA1 naudoja galvanometro nuskaitymo galvutę, kurios skiriamoji geba yra didesnė nei A1R su hibridine nuskaitymo galvute, bet šiek tiek lėtesnė (A1R ~ 30 kadrų per sekundę).
