Kodėl mums reikia konfokalinės mikroskopijos?
1. Po didžiųjų mūsų pirmtakų pastangų ir patobulinimų optinis mikroskopas pasiekė tobulą lygį. Tiesą sakant, įprasti mikroskopai gali mums paprastai ir greitai pateikti gražius mikroskopinius vaizdus. Tačiau įvyko įvykis, atnešęs revoliucines naujoves į šį beveik tobulą mikroskopų pasaulį – tai buvo „lazerinio skenuojančio konfokalinio mikroskopo“ išradimas. Šio naujo tipo mikroskopo ypatybė yra ta, kad jame įdiegta optinė sistema, kuri išgauna vaizdo informaciją tik tame paviršiuje, kuriame yra sutelktas dėmesys. Pakeitus židinį ir atkurdamas gautą informaciją vaizdų atmintyje, jis gali gauti ryškius vaizdus su pilnu 3D informaciniu intelektu. Taikant šį metodą galima lengvai gauti informaciją apie paviršiaus formą, kurios negalima patvirtinti įprastais mikroskopais. Be to, tipiniams optiniams mikroskopams „didėjanti skiriamoji geba“ ir „didėjantis židinio gylis“ yra prieštaringos sąlygos, ypač esant dideliam padidinimui. Tačiau konfokaliniuose mikroskopuose ši problema lengvai išsprendžiama.
2. Konfokalinių optinių sistemų privalumai
Taškiniam mėginio apšvietimui naudojama konfokalinė optinė sistema, o atspindėtą šviesą taip pat priima taškinis jutiklis. Kai mėginys dedamas į židinio padėtį, jutiklį gali pasiekti beveik visa atspindėta šviesa. Kai mėginys nukrypsta nuo židinio taško, atspindėta šviesa negali pasiekti jutiklio. Tai reiškia, kad konfokalinėje optinėje sistemoje bus išvedamas tik vaizdas, kuris sutampa su židiniu, o taškas ir nenaudinga išsklaidyta šviesa bus ekranuoti.
Kodėl naudoti lazerį?
Konfokalinėse optinėse sistemose mėginiui taikomas taškinis apšvietimas, o atspindėtą šviesą taip pat priima taškinis jutiklis. Todėl taškiniai šviesos šaltiniai tapo būtini. Lazeris yra labai taškinis šviesos šaltinis. Daugeliu atvejų konfokalinės mikroskopijos šviesos šaltinis yra lazeris. Be to, lazerių monochromiškumas, kryptingumas ir puiki spindulio forma taip pat yra svarbios priežastys, kodėl jie plačiai naudojami.
4. Įmanomas stebėjimas realiu laiku, pagrįstas didelės spartos nuskaitymu
Lazeriniam skenavimui naudojamas akustinis optinis reflektorius (AO) horizontalia kryptimi ir Servo Galvano veidrodis vertikalia kryptimi. Kadangi garso optinio poslinkio bloke nėra mechaninių vibracijų, galima atlikti greitą nuskaitymą ir stebėti realiu laiku stebėjimo ekrane. Didelis šio tipo fotoaparato greitis yra labai svarbus veiksnys, tiesiogiai įtakojantis fokusavimą ir padėties atkūrimo greitį.
5. Ryšys tarp židinio padėties ir ryškumo
Konfokalinėje optinėje sistemoje, kai mėginys yra teisingai padėtas į židinio padėtį, šviesumas yra didelis, o prieš jį ir po jo ryškumas smarkiai sumažėja (ištisinė linija 4 paveiksle). Šios židinio plokštumos jautrus selektyvumas yra būtent aukščio krypties nustatymo ir židinio gylio išplėtimo konfokalinėje mikroskopijoje principas. Palyginti su tuo, tipiniai optiniai mikroskopai nerodo reikšmingų ryškumo pokyčių prieš ir po židinio padėties (punktyrinė linija 4 paveiksle).
6. Didelis kontrastas ir raiška
Tipiškas optinis mikroskopas dėl trukdžių, kuriuos sukelia atspindėta šviesa, nukrypstanti nuo židinio taško, sutampa su židinio vaizdavimo dalimi, todėl sumažėja vaizdo kontrastas. Priešingai, konfokalinėse optinėse sistemose išsklaidyta šviesa už židinio ribų ir išsklaidyta šviesa objektyvo lęšio viduje beveik visiškai pašalinama, todėl gaunami labai didelio kontrasto vaizdai. Be to, dėl to, kad šviesa pro objektyvo lęšį praeina du kartus, taškinis vaizdas pirmiausia tampa ryškesnis, o tai taip pat pagerina mikroskopo skiriamąją gebą.
