Kokia konfokalinio mikroskopo paskirtis?
1. Po didžiųjų mūsų pirmtakų pastangų ir patobulinimų optinis mikroskopas pasiekė tobulumo tašką. Tiesą sakant, įprasti mikroskopai gali mums paprastai ir greitai pateikti gražius mikroskopinius vaizdus. Tačiau įvyko įvykis, atnešęs revoliucines naujoves į šį beveik tobulą mikroskopų pasaulį – tai „lazerinio skenuojančio konfokalinio mikroskopo“ išradimas. Šio naujo tipo mikroskopo ypatybė yra ta, kad jame įdiegta optinė sistema, kuri išgauna vaizdo informaciją tik tame paviršiuje, kuriame sutelktas dėmesys, ir atkuria gautą informaciją vaizdo atmintyje keičiant fokusą, kad būtų galima gauti visą 3D informaciją. gautas. Ryškus intelekto vaizdas. Šiuo metodu galima nesunkiai gauti informaciją apie paviršiaus formą, kurios neįmanoma patvirtinti įprastu mikroskopu. Be to, paprastiems optiniams mikroskopams „didinanti skiriamoji geba“ ir „didėjantis fokusavimo gylis“ yra prieštaringos sąlygos, ypač esant dideliam padidinimui, šis prieštaravimas yra ryškesnis, tačiau kalbant apie konfokalinius mikroskopus, ši problema lengvai išsprendžiama.
2. Konfokalinės optinės sistemos privalumai
Lazerinio konfokalinio mikroskopo schema
Konfokalinė optinė sistema atlieka taškinį mėginio apšvietimą, o atspindėtą šviesą taip pat priima taškinis receptorius. Kai mėginys dedamas į fokusavimo padėtį, beveik visa atspindėta šviesa gali pasiekti fotoreceptorių, o kai mėginys yra nefokusuotas, atspindėta šviesa negali pasiekti fotoreceptoriaus. Tai reiškia, kad konfokalinėje optinėje sistemoje bus išvedamas tik vaizdas, kuris sutampa su židinio tašku, o šviesos dėmės ir nenaudinga išsklaidyta šviesa bus ekranuoti.
3. Kodėl naudoti lazerį?
Konfokalinėje optinėje sistemoje pavyzdys apšviečiamas taške, o atspindėtą šviesą taip pat priima taškinis fotoreceptorius. Todėl taškinis šviesos šaltinis tampa būtinas. Lazeriai yra labai taškiniai šviesos šaltiniai. Daugeliu atvejų lazeriniai šviesos šaltiniai naudojami kaip konfokalinių mikroskopų šviesos šaltiniai. Be to, monochromatiškumo, kryptingumo ir puikios lazerio spindulio formos savybės taip pat yra svarbios priežastys, dėl kurių jis plačiai naudojamas.
4. Įmanomas stebėjimas realiuoju laiku, pagrįstas didelės spartos nuskaitymu
Lazeriniam skenavimui naudojamas akustiniu būdu įjungiamas optinis nukreipimo blokas (Acoustic Optical Deflector, AO elementas) horizontalia kryptimi, o Servo Galvano veidrodis – vertikalia kryptimi. Kadangi akustinio-optinio nukreipimo blokas neturi mechaninės vibracijos dalies, jis gali atlikti greitą nuskaitymą ir monitoriaus ekrane galima stebėti realiu laiku. Šis didelės spartos vaizdavimas yra labai svarbus elementas, kuris tiesiogiai veikia fokusavimo ir padėties nustatymo greitį.
5. Ryšys tarp židinio padėties ir ryškumo
Konfokalinėje optinėje sistemoje mėginio ryškumas yra didžiausias, kai mėginys yra teisingai padėtas židinio padėtyje, o jo ryškumas smarkiai sumažės prieš jį ir po jo (ištisinė linija 4 paveiksle). Jautrus židinio plokštumos selektyvumas taip pat yra konfokalinio mikroskopo aukščio krypties nustatymo ir židinio gylio išplėtimo principas. Priešingai, įprasti optiniai mikroskopai neturi reikšmingų ryškumo pokyčių prieš ir po fokusavimo padėties.
6. Didelis kontrastas, didelė raiška
Įprastuose optiniuose mikroskopuose dėl atspindėtos šviesos trukdžių nuo fokusavimo dalies ji sutampa su fokusavimo vaizdo dalimi, todėl vaizdo kontrastas sumažėja. Kita vertus, konfokalinėje optinėje sistemoje išsklaidyta šviesa už židinio taško ir išsklaidyta šviesa objektyvo lęšio viduje beveik visiškai pašalinama, todėl galima gauti labai didelio kontrasto vaizdą. Be to, kadangi šviesa pro objektyvo lęšį praeina du kartus, pirmiausia paryškinamas taškinis vaizdas, o tai taip pat pagerina mikroskopo skiriamąją gebą.
7. Optinės lokalizacijos funkcija
Konfokalinėje optinėje sistemoje atspindėta šviesa, išskyrus tašką, kuris sutampa su židinio tašku, yra ekranuojamas mikroporų. Todėl stebint trimatį mėginį susidaro vaizdas taip, lyg mėginys būtų perpjautas su židinio plokštuma (5 pav.). Šis efektas žinomas kaip optinė lokalizacija ir yra viena iš konfokalinių optinių sistemų ypatumų.
8. Fokusavimo mobiliosios atminties funkcija
Vadinamoji atsispindėjusi šviesa už židinio taško yra apsaugota mikroporomis. Kita vertus, galima manyti, kad visi konfokalinės optinės sistemos suformuoti vaizdo taškai sutampa su židinio tašku. Todėl, jei trimatis mėginys perkeliamas išilgai Z ašies (optinės ašies), vaizdai kaupiami ir saugomi atmintyje, o galiausiai bus gautas vaizdas, suformuotas iš visos imties ir židinio taško. Tokiu būdu be galo pagilinti fokusavimo gylį funkcija vadinama mobiliosios atminties funkcija.
9. Paviršiaus formos matavimo funkcija
Kalbant apie židinio poslinkio funkciją, mėginio paviršiaus formą galima išmatuoti bekontakčiu būdu, pridedant paviršiaus aukščio įrašymo grandinę. Remiantis šia funkcija, galima įrašyti Z ašies koordinates, kurias sudaro didžiausia skaisčio reikšmė kiekviename pikselyje, o remiantis šia informacija galima gauti informaciją, susijusią su mėginio paviršiaus forma.
10. Didelio tikslumo mikro dydžio matavimo funkcija
Šviesos priėmimo įrenginyje yra 1-matmenų CCD vaizdo jutiklis, todėl jo neveikia nuskaitymo įrenginio nuskaitymo pokrypis, kad būtų galima atlikti didelio tikslumo matavimus. Be to, naudojant fokusavimo poslinkio atminties funkciją su reguliuojamu židinio gyliu (gilinimu), galima pašalinti matavimo paklaidą, kurią sukelia fokusavimo poslinkis.
11. Trimačio vaizdo analizė
Naudodami paviršiaus formos matavimo funkciją galite lengvai sukurti trimatį mėginio paviršiaus vaizdą. Ne tik tai, bet ir galima atlikti įvairias analizes, tokias kaip: paviršiaus šiurkštumo matavimas, plotas, tūris, paviršiaus plotas, apskritimas, spindulys, maksimalus ilgis, perimetras, svorio centras, tomografinis vaizdas, FFT transformacija, linijos pločio matavimas ir kt. .
Lazerinis konfokalinis skenuojantis mikroskopas gali būti naudojamas ne tik ląstelių morfologijos stebėjimui, bet ir kiekybinei intraląstelinių biocheminių komponentų analizei, optinio tankio statistikai bei ląstelių morfologijos matavimui.
