Dviejų fotonų fluorescencinė mikroskopija turi daug privalumų:
1) Ilgesnio bangos ilgio šviesos sklaida yra mažiau veikiama nei trumpesnio ilgio šviesos bangos ilgiai, kad prasiskverbtų į bandinį;
(2) Fluorescencinės molekulės, esančios už židinio plokštumos, nėra sužadintos, kad daugiau sužadinimo šviesos galėtų pasiekti židinio plokštumą, kad sužadinimo šviesa galėtų prasiskverbti giliau į bandinį;
3) ilgesni artimos infraraudonosios šviesos bangos yra mažiau toksiški ląstelėms nei trumpesni bangos ilgiai;
4) Kai mėginiui stebėti naudojamas dviejų fotonų mikroskopas, fotobalinimas ir fototoksiškumas yra tik židinio plokštumoje. Todėl dviejų fotonų mikroskopai yra tinkamesni nei vieno fotono mikroskopai storiems mėginiams stebėti, gyvoms ląstelėms stebėti arba taškiniams fotobalinimo eksperimentams atlikti.
Konfokalinio fluorescencinio mikroskopo žinios
Pagrindinis konfokalinio fluorescencinio mikroskopo principas: taškinis šviesos šaltinis naudojamas bandiniui apšvitinti, formuojant nedidelį, aiškiai apibrėžtą šviesos tašką židinio plokštumoje. Fluorescencija, skleidžiama iš šio taško po švitinimo, surenkama objektyvo ir siunčiama atgal į pluošto skirstytuvą, kurį sudaro dvikryptis chromatinis veidrodis, palei pradinį švitinimo šviesos kelią. Spindulio skirstytuvas siunčia fluorescenciją tiesiai į detektorių. Tiek šviesos šaltinis, tiek detektorius turi po skylutę, atitinkamai vadinamą apšvietimo pinhole ir aptikimo skylute. Abu turi tą pačią geometriją, apie 100-200 nm, ir yra konjuguoti šviesos taško židinio plokštumoje atžvilgiu, ty šviesos taškas eina per lęšių seriją ir galiausiai gali būti sufokusuotas į abu šviečiančius ir detektoriaus skylutes. Tokiu būdu šviesa iš židinio plokštumos gali susilieti zondo apertūroje, o išsklaidyta šviesa iš viršaus arba žemiau židinio plokštumos yra užblokuota už zondo angos ir negali būti vaizduojama. Lazeris taškas po taško nuskaito mėginį, o fotodaugintuvo vamzdelis, aptikęs skylutę, taip pat taškas po taško gauna atitinkamo šviesos taško konfokalinį vaizdą, kuris paverčiamas skaitmeniniu signalu ir perduodamas į kompiuterį, o galiausiai suartėja į aiškų vaizdą. konfokalinis visos židinio plokštumos vaizdas ekrane.
Kiekvienas židinio plokštumos vaizdas iš tikrųjų yra optinis bandinio skerspjūvis, o šis optinis skerspjūvis visada turi tam tikrą storį, dar vadinamą optiniu lakštu. Kadangi šviesos intensyvumas židinio taške yra daug didesnis nei ne židinio taške, o ne židinio plokštumos šviesą išfiltruoja skylutė, konfokalinės sistemos lauko gylis apytikslis lygus nuliui, o nuskaitymas išilgai Z ašies krypties leidžia optinei tomografijai suformuoti dvimatį optinį mėginio pjūvį, kurį galima stebėti židinio vietoje. Sujungus XY plokštumos (židinio plokštumos) skenavimą su Z ašies (optinės ašies) skenavimu, kaupiant nuoseklius dvimačių vaizdų sluoksnius galima gauti trimatį mėginio vaizdą, kuris apdorojamas specializuota kompiuterine programine įranga.
Tai reiškia, kad aptikimo skylutė ir šviesos šaltinio skylutė visada sufokusuotos tame pačiame taške, todėl fluorescencija, sužadinta už židinio plokštumos, negali patekti į aptikimo angą.
Lazerinio konfokalinio lazerio veikimo principas yra tiesiog išreikštas tuo, kad jis naudoja lazerį kaip šviesos šaltinį, remdamasis tradiciniu fluorescenciniu mikroskopu, papildomu lazeriniu skenavimo įrenginiu ir konjuguoto fokusavimo įtaisu, per kompiuterinį valdymą skaitmeninio vaizdo gavimo ir apdorojimo sistemai atlikti.
