Dviejų fotonų fluorescencinė mikroskopija turi daug privalumų
1) Ilgos bangos šviesa yra mažiau veikiama sklaidos nei trumpos bangos šviesa ir gali lengvai prasiskverbti į mėginį;
2) Fluorescencinės molekulės, esančios už židinio plokštumos, nėra sužadintos, todėl židinio plokštumą pasiekia daugiau sužadinimo šviesos, leidžianti sužadinimo šviesai prasiskverbti į gilesnius mėginius;
3) ilgosios bangos artimųjų infraraudonųjų spindulių šviesa yra mažiau toksiška ląstelėms nei trumpabangioji šviesa;
4) Stebint mėginius dviejų fotonų mikroskopu, fotobalinimas ir fototoksiškumas atsiranda tik židinio plokštumoje. Todėl dviejų fotonų mikroskopai labiau tinka nei vieno fotono mikroskopai storiems mėginiams stebėti, gyvoms ląstelėms stebėti ar fiksuoto taško fotobalinimo eksperimentams atlikti.
Žinios apie konfokalinę fluorescencinę mikroskopiją
Pagrindinis konfokalinės fluorescencinės mikroskopijos principas: naudokite taškinį šviesos šaltinį, kad apšviestumėte mėginį, kad židinio plokštumoje susidarytų mažas, aiškiai apibrėžtas šviesos taškas. Fluorescencija, kurią skleidžia taškas po apšvietimo, surenkama objektyvo ir grąžinama į dichroinį veidrodį palei pradinį apšvietimo šviesos kelią. sudaro pluošto skirstytuvą. Spektrometras siunčia fluorescenciją tiesiai į detektorių. Priešais šviesos šaltinį ir detektorių yra skylutė, kurios atitinkamai vadinamos apšvietimo smeigtuku ir aptikimo skylute. Geometriniai abiejų matmenys yra vienodi, apie 100-200nm; Palyginti su šviesos tašku židinio plokštumoje, jie abu yra sujungti, tai yra, šviesos taškas praeina per lęšių seriją ir galiausiai gali būti sufokusuotas į apšvietimo angą ir aptikimo skylutę tuo pačiu metu. Tokiu būdu šviesa iš židinio plokštumos gali būti sutelkta aptikimo angoje, o išsklaidyta šviesa iš viršaus arba žemiau židinio plokštumos yra užblokuota už aptikimo angos ir negali būti vaizduojama. Mėginys taškas po taško nuskaitomas lazeriu, o už aptikimo skylutės esantis fotodauginimo vamzdelis taip pat taškas po taško gauna atitinkamo šviesos taško konfokalinį vaizdą, kuris paverčiamas skaitmeniniu signalu ir perduodamas į kompiuterį, o galiausiai sujungiamas. ekrane į aiškų konfokalinį visos židinio plokštumos vaizdą. .
Kiekvienas židinio plokštumos vaizdas iš tikrųjų yra optinis bandinio skerspjūvis. Šis optinis skerspjūvis visada turi tam tikrą storį ir dar vadinamas optiniu plonu pjūviu. Kadangi šviesos intensyvumas židinyje yra daug didesnis nei šviesos intensyvumas nefokusuotame taške, o ne židinio plokštumos šviesa filtruojama skylute, konfokalinės sistemos lauko gylis yra apytiksliai lygus nuliui. Skenuojant pagal Z ašies kryptį galima atlikti optinę tomografiją, suformuojant pageidaujamą. Stebėkite dvimatę optinę pjūvį sufokusuotoje mėginio vietoje. XY plokštumos (židinio plokštumos) skenavimą derinant su Z ašies (optinės ašies) skenavimu, kaupiant ištisinius dvimačių vaizdų lygius ir juos apdorojant specializuota kompiuterine programine įranga, galima gauti trimatį mėginio vaizdą.
Tai reiškia, kad aptikimo skylutė ir šviesos šaltinio skylutė visada sufokusuojamos į tą patį tašką, todėl fluorescencija, sužadinta už fokusavimo plokštumos, negali patekti į aptikimo angą.
Paprasta lazerio konfokalinio veikimo principo išraiška yra ta, kad jis naudoja lazerį kaip šviesos šaltinį. Remiantis tradiciniu fluorescenciniu mikroskopu, pridedamas lazerinis skenavimo įrenginys ir konjuguoto fokusavimo įrenginys, o sistema valdoma kompiuteriu, kad būtų galima rinkti ir apdoroti skaitmeninius vaizdus.
