Dažymo metodai ir mikroskopinis mikroorganizmų stebėjimas
1. Tikslas
1.1 Išmokti pagrindinius mikrobinio tepinėlio ir dažymo būdus.
1.2 Įvaldykite paprastą bakterijų dažymo metodą.
1.3 Iš anksto suprasti bakterijų morfologines charakteristikas ir įtvirtinti žinias, kaip naudoti alyvos lęšius ir aseptinio veikimo būdus.
2 Principai
Bakterijų tepimas ir dažymas yra pagrindinis mikrobiologijos eksperimentų metodas. Bakterijų ląstelės yra mažos ir skaidrios, todėl jas sunku identifikuoti įprastu šviesos mikroskopu; jie turi būti nudažyti. Bakterijoms dažyti naudojamas vienas dažiklis, kad nudažytos bakterijos susidarytų aiškų spalvų skirtumą nuo fono, kad būtų galima aiškiau stebėti jų morfologiją ir struktūrą. Šis metodas yra lengvai valdomas ir tinka bendrai bakterijų ląstelių formai bei bakterijų išsidėstymui stebėti. Paprastam dažymui dažniausiai naudojami pagrindiniai dažai. Taip yra todėl, kad neutraliuose, šarminiuose ar silpnai rūgštiniuose tirpaluose bakterijų ląstelės dažniausiai būna neigiamai įkrautos, o jonizuojantis baziniams dažams dažanti jų molekulių dalis yra teigiamai įkraunama, todėl jos yra šarminės. Dažanti dažų dalis lengvai susijungia su bakterijomis, kad jas nuspalvintų. Dažytos bakterijų ląstelės ryškiai kontrastuoja su fonu, todėl jas lengviau atpažinti mikroskopu. Dažai, dažniausiai naudojami paprastam dažymui, yra metileno mėlynasis, krištolinis violetinis, bazinis fuksinas ir kt. Kai bakterijos skaido cukrų ir gamina rūgštį, dėl ko nukrenta auginimo terpės pH, padidėja teigiamas bakterijų krūvis. Šiuo metu dažymui galima naudoti rūgštinius dažus, tokius kaip eozinas, rūgštus fuksinas arba Kongo raudona. Prieš dažymą bakterijos turi būti fiksuotos. Jis turi du tikslus: vienas – sunaikinti bakterijas ir priversti jas prilipti prie stiklelio; kita – padidinti jų afinitetą dažams. Du dažniausiai naudojami metodai yra kaitinimas ir cheminis fiksavimas. Tvirtindami stenkitės išlaikyti pirminę ląstelių formą.
3 medžiagos
3.1 Bakterijos: Bacillus subtilis 12-18h maistinio agaro įstrižainė kultūra, Staphylococcus aureus 24h maistinio agaro įstrižainė kultūra, Escherichia coli 24h maistinio agaro įstrižainė kultūra,kepimo mielių agaro pasvirusi kultūra.
3.2 Dažiklis: Lu šarminis metileno mėlynasis dažiklis (arba amonio oksalato kristalinis violetinis dažiklis), karbolio rūgšties fuksino dažai.
3.3 Instrumentai ar kiti indai: mikroskopas, alkoholio lempa, stiklelis, skiepijimo kilpa, stiklelių stovas, dvisluoksnis buteliukas (su kedro aliejaus ir ksileno), lęšių audinys, fiziologinis fiziologinis tirpalas arba distiliuotas vanduo ir kt.
4. Procesas: tepinėlis → džiovinimas → fiksavimas → dažymas → plovimas → džiovinimas → mikroskopinis tyrimas.
5 žingsniai
5.1 Tepimas: paimkite dvi švarias ir be alyvos stiklines. Steriliomis sąlygomis ant kiekvieno stiklelio centro užlašinkite po nedidelį lašelį įprasto fiziologinio tirpalo (arba distiliuoto vandens). Norėdami sterilizuoti Bacillus subtilis bakterijas, naudokite inokuliavimo kilpą. , Micrococcus luteus ir Escherichia coli, ant nuožulnios pusės esančiuose vandens lašeliuose paimkite šiek tiek bakterinės vejos, gerai išmaišykite ir užtepkite plona plėvele. Jei naudojate bakterijų suspensijos (arba skystos kultūros) tepinėlį, sėjimo kilpa galite pasirinkti 2–3 kilpas ir užtepti jas tiesiai ant stiklelio. Būkite atsargūs, kad nenuleistumėte per daug fiziologinio fiziologinio tirpalo (distiliuoto vandens), pašalinkite bakterijas ir tepkite tolygiai, o ne per storai.
5.2 Džiovinimas Natūraliai išdžiovinkite kambario temperatūroje. Taip pat galite šiek tiek pašildyti virš alkoholio lempos padengta puse į viršų, kad išdžiūtų. Tačiau būtinai nesiartinkite prie liepsnos, nes per aukšta temperatūra sunaikins bakterijų morfologiją.
5.3 Fiksavimas Jei naudojamas džiovinimas kaitinant, fiksavimas ir džiovinimas sujungiami į vieną etapą, o metodas yra toks pat kaip ir džiovinimas. Ištepti, išdžiovinti ir termiškai pritvirtinti.
5.4 Dažymas: padėkite stiklelį ant stiklelių stovo ir įlašinkite 1–2 lašus dažų tirpalo ant tepinėlio (tinkama, kad dažų tirpalas tiesiog padengtų tepinėlio plėvelę). Dažykite Lu baziniu metileno mėlynu 1–2 minutes, o karbolio rūgšties fuksinu (arba amonio oksalato kristaliniu violetiniu) – maždaug 1 minutę.
5.5 Plovimas vandeniu: Nupilkite dažų tirpalą ir švelniai nuplaukite vandeniu iš čiaupo nuo vieno stiklelio galo, kol nuo tepinėlio tekantis vanduo taps bespalvis. Plaunant vandeniu, neplaukite padengto paviršiaus tiesiogiai vandeniu. Vandens srautas neturi būti per greitas arba per didelis, kad nenukristų tepinėlis.
5.6 Džiovinimas: Nukratykite vandens lašelius ant stiklelio ir išdžiovinkite natūraliai, išdžiovinkite plaukų džiovintuvu arba sugerkite jį sugeriančiu popieriumi (atsargiai, kad nenuvalytų bakterijų). 5.7 Mikroskopinis tyrimas Po to, kai tepinėlis išdžius, atlikite mikroskopinį tyrimą. Prieš apžiūrint su alyvos lęšiu, tepinėlis turi būti visiškai išdžiūvęs.
6 Rezultatai Nubraižykite E. coli ir Micrococcus luteus morfologiją, pastebėtą po vienkartinio dažymo.
