Dažymo būdai ir mikroskopinis mikroorganizmų stebėjimas
Paprastas bakterijų dažymas
1 Tikslai
1.1 Išmokti pagrindinius mikrobinio tepinėlio ir dažymo būdus.
1.2 Įvaldyti paprastą bakterijų dažymo metodą.
1.3 Pažinti bakterijų morfologines ypatybes ir įtvirtinti aliejinio veidrodžio naudojimo bei aseptinio veikimo technikos mokymąsi.
2 Principas Bakterijų tepinėlis ir dažymas yra pagrindinis mikrobiologijos eksperimentų metodas. Bakterijų ląstelės yra mažos ir skaidrios, jas nelengva atpažinti po įprastu šviesos mikroskopu, jos turi būti nudažytos. Vieno dažo naudojimas bakterijoms nudažyti, kad nudažytas organizmas ir fonas susidarytų aiškų spalvų skirtumą, kad būtų galima aiškiau stebėti jų morfologiją ir struktūrą. Šį metodą lengva atlikti ir jis tinka bendrai organizmo formai bei bakterijų išsidėstymui stebėti. Šarminiai dažai dažniausiai naudojami paprastam dažymui, nes neutraliuose, šarminiuose ar silpnai rūgščiuose tirpaluose bakterijų ląstelės dažniausiai būna neigiamai įkraunamos, o kai šarminiai dažai jonizuojami, jų molekulių dažanti dalis yra teigiamai įkraunama, taigi šarminių dažų dažančioji dalis. gali lengvai prisijungti prie bakterijų, kad bakterijos taptų spalvotos. Dažytos bakterijų ląstelės ryškiai kontrastuoja su fonu ir yra lengviau atpažįstamos po mikroskopu. Dažniausiai naudojami dažai paprastam dažymui yra merocianino mėlyna, krištolo violetinė ir bazinė raudona. Kai cukrus suyra bakterijoms, kad susidarytų rūgštis, kad terpės pH sumažėtų, teigiamas bakterijų krūvis padidėja, o tada gali būti naudojamas raudonai, rūgštai raudonai arba Kongo raudonai ir kitiems rūgštiniams dažams dažyti. Prieš dažymą bakterijos turi būti fiksuotos. Jo paskirtis dvejopa: viena – sunaikinti bakterijas ir priversti bakterijas prilipti prie stiklelio; antrasis – padidinti jo afinitetą dažams. Dažniausiai naudojami du būdai: kaitinimas ir cheminis fiksavimas. Tvirtindami stenkitės išlaikyti pirminę ląstelių morfologiją.
3 Medžiagos
3.1 Padermė Bacillus subtilis 12-18h maistinio agaro įstrižainė kultūra, Staphylococcus aureus apie 24h maistinio agaro įstrižainė kultūra, Escherichia coli 24h maistinio agaro įstrižinė kultūra,kepinių mielių agaro pasvirusi kultūra.
3.2. Dažykite Lue šarminį metileno mėlynąjį dėmę (arba amonio oksalato kristalinį violetinį dėmę), karbolio rūgšties junginio raudoną dėmę.
3.3 Instrumentai ar kita įranga Mikroskopas, alkoholio lempa, stiklelis, inokuliavimo žiedas, stiklelio laikiklis, dvisluoksnis buteliukas (užpildytas kedro aliejaus ir ksileno), mikroskopo popierius, fiziologinis fiziologinis tirpalas arba distiliuotas vanduo ir kt.
4 Procedūra Tepinėlis → džiovinimas → fiksavimas → dažymas → plovimas → džiovinimas → mikroskopinis tyrimas.
5 žingsniai
5.1 tepinėlis Paimkite dvi švarias ir be aliejaus stikleles, kurių centre aseptinėmis sąlygomis įlašinamas nedidelis fiziologinio tirpalo (arba distiliuoto vandens) lašelis, su inokuliavimo žiedu, kad aseptiškai veiktų atitinkamai iš Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus. ir Escherichia coli įstrižai nuskinti šiek tiek samanų vandens laše, sumaišyti ir padengti plėvele. Jei bakterijų suspensijos (arba skystos kultūros) tepinėlis gali būti naudojamas žiedui inokuliuoti, paimkite 2–3 žiedus tiesiai ant stiklelio. Atkreipkite dėmesį, kad fiziologinio tirpalo (distiliuoto vandens) ir paimkite bakterijas neturėtų būti per daug ir paskirstykite tolygiai, ne per storai.
5.2 Džiovinimas Natūraliai išdžiovinkite kambario temperatūroje. Jį taip pat galima džiovinti šiek tiek kaitinant virš alkoholio lempos padengta puse į viršų. Tačiau nesiartinkite prie liepsnos, nes per aukšta temperatūra sunaikins bakterijų morfologiją.
5.3 Fiksavimas Jei naudojamas džiovinimas karštyje, fiksavimas ir džiovinimas sujungiami į vieną žingsnį taip pat, kaip ir džiovinimas. Ištepti, išdžiovinti ir termiškai pataisyti.
5.4 Dažymas Padėkite stiklelį ant stiklelių lentynos, įlašinkite 1–2 lašus dažančio tirpalo ant tepinėlio (tinkamas dažymo tirpalas tiesiog uždengia tepinėlio plėvelę). Dažykite tepinėlį Lü's Basic Mellanox Blue 1–2 min., o karbonato raudonu (arba amonio oksalato kristaliniu violetiniu) – apie 1 min.
5.5 Skalavimas Nupilkite dažymo tirpalą ir švelniai nuplaukite vandeniu iš čiaupo nuo vieno stiklelio galo, kol nuo tepinėlio tekantis vanduo taps bespalvis. Skalaujant neleiskite vandeniui tiesiogiai nuplauti padengto paviršiaus. Vandens srautas neturi būti per greitas arba per didelis, kad neišslinktų tepinėlis.
5.6 Džiovinimas Nukratykite vandens lašelius ant stiklelio, kad natūraliai išdžiūtų, džiovinimui galite naudoti sugeriantį popierių arba naudokite sugeriantį popierių (būkite atsargūs ir nenušluostykite bakterijų kūno). 5.7 Mikroskopinis tyrimas Tepinėlis išdžiovinamas ir tiriamas mikroskopu. Kad būtų galima jį stebėti aliejaus mikroskopu, tepinėlis turi būti visiškai sausas.
6 Rezultatai Nubraižykite E. coli ir Micrococcus garciniae morfologiją po vienkartinio dažymo.
Gramo dėmės
1 Paskirtis
1.1 Suprasti Gramo dažymo principą ir jo svarbą klasifikuojant ir identifikuojant bakterijas.
1.2 Išmokti ir įsisavinti Gramo dažymo techniką bei įtvirtinti šviesos mikroskopo aliejinio lęšio naudojimo mokymąsi.
