Didelės skiriamosios gebos mikroskopijos ribų peržengimas: savaime išsilyginanti mikroskopija
Itin tiksli mikroskopija, kuri peržengia Nobelio premijos laureato didelės raiškos mikroskopo ribas, leis mokslininkams tiesiogiai išmatuoti atstumus tarp atskirų molekulių.
Naujojo Pietų Velso universiteto medicinos mokslininkai pasiekė precedento neturinčią skiriamąją gebą vienos molekulės mikroskopijoje, kad aptiktų sąveiką tarp atskirų molekulių nepažeistose ląstelėse.
2014 m. Nobelio chemijos premija buvo skirta už itin didelės skiriamosios gebos fluorescencinės mikroskopijos technologijos sukūrimą, kuri suteikė mikroskopams pirmąjį ląstelės vidaus molekulinį vaizdą – funkciją, kuri suteikia naujų sudėtingų biologinių sistemų ir procesų molekulinių vaizdų.
Dabar vienos molekulės mikroskopijos aptikimo ribos buvo dar kartą padidintos, o detalės buvo paskelbtos naujausiame „Science Advances“ numeryje.
Buvo įmanoma stebėti ir sekti atskiras molekules naudojant itin didelės skiriamosios gebos mikroskopus, tačiau sąveika tarp šių molekulių vyksta tokiu mastu, kuris yra mažiausiai keturis kartus mažesnis nei išspręstas esamais vienos molekulės mikroskopais.
"Priežastis, dėl kurios vienos molekulės mikroskopų lokalizacijos tikslumas paprastai yra apie 20–30 nanometrų, dažniausiai yra dėl to, kad aptikdamas signalus mikroskopas iš tikrųjų juda. Dėl to atsiranda netikrumo. Naudodami esamus didelės skiriamosios gebos instrumentus galime nesugebėti nustatyti, ar vienas baltymas yra prijungtas prie kitas, nes atstumas tarp jų yra trumpesnis nei jų padėties neapibrėžtumas.
Norėdami išspręsti šią problemą, komanda sukūrė automatinę grįžtamojo ryšio kilpą vienos molekulės mikroskopo viduje, kuri aptinka ir iš naujo suderina optinį kelią ir veidrodžio stadiją.
„Nesvarbu, ką darai su šiuo mikroskopu, jis iš esmės nanometro tikslumu suranda grįžtamąjį kelią. Tai išmanusis mikroskopas. Jis gali padaryti viską, ką turi operatorius ar techninės priežiūros inžinierius, ir gali tai padaryti 12 kartų per sekundę. “ Prof. Gossas sakė.
Atstumo tarp baltymų matavimas
Pagal šiame dokumente aprašytą dizainą ir metodiką UNSW komanda sukūrė grįžtamojo ryšio sistemą, suderinamą su esamais mikroskopais ir suteikiančią maksimalų lankstumą ruošiant mėginius.
"Tai labai paprastas ir elegantiškas pagrindinės vaizdo gavimo problemos sprendimas. Mes ką tik pastatėme mikroskopą mikroskopo viduje ir viskas, ką padarėme, buvo sulygiuoti pagrindinį mikroskopą. Rasto sprendimo paprastumas ir praktiškumas yra tikroji jo stiprybė. Tai lengva klonuoti sistemą ir greitai pritaikyti naujas technologijas. Prof. Gossas sakė.
Siekdami parodyti itin tikslaus grįžtamojo ryšio vienos molekulės mikroskopo naudingumą, mokslininkai jį panaudojo tiesioginiams atstumo matavimams tarp signalizuojančių baltymų T ląstelėse. Įprasta ląstelių imunologijos prielaida yra ta, kad šios imuninės ląstelės lieka ramios, kai T ląstelių receptorius yra arti kitos molekulės, kuri veikia kaip stabdis.
Jų didelio tikslumo mikroskopija sugebėjo parodyti, kad dvi signalinės molekulės iš tikrųjų buvo toliau atskirtos viena nuo kitos aktyvuotose T ląstelėse, atleidžiant stabdį ir įjungiant T ląstelių receptorių signalizaciją.
Prof. Gossas sakė: „Įprasti mikroskopijos metodai negalėtų tiksliai išmatuoti tokio nedidelio pokyčio, nes atstumas tarp šių signalinių molekulių ramybės būsenoje ir aktyvuotose T ląstelėse skiriasi tik 4-7 nanometrais“.
"Tai taip pat parodo, kokie jautrūs šie signalizacijos mechanizmai yra erdvinei izoliacijai. Norėdami nustatyti tokius reguliavimo procesus, turime atlikti tikslius atstumo matavimus, kuriuos leidžia šis mikroskopas. Šie rezultatai rodo, kad technologija yra atrandama ir negali būti pagaminta kitu būdu“.
