Mikrobiologinis mikroskopinis tiesioginis skaičiavimas
Eksperimento principas
Tiesioginis skaičiavimas mikroskopu naudojant hemocitometrą yra dažniausiai naudojamas mikrobų skaičiavimo metodas. Šio metodo pranašumas yra tai, kad jis yra intuityvus ir greitas. Tinkamai praskiestą bakterijų suspensiją (arba sporų suspensiją) įdėkite į skaičiavimo kamerą tarp stiklelio ir hemocitometro dengiamojo stiklo ir suskaičiuokite po mikroskopu. Kadangi skaičiavimo kameros tūris yra fiksuotas (0.1mm2), jį galima konvertuoti į bendrą mikroorganizmų skaičių tūrio vienete pagal mikroskopu stebimų mikroorganizmų skaičių. Kadangi šis metodas skaičiuoja gyvų ir negyvų bakterijų sumą, jis taip pat vadinamas bendro bakterijų skaičiavimo metodu.
Hemocitometras paprastai yra specialus stiklinis stiklelis, ant kurio keturi grioveliai sudaro tris platformas. Viduryje esanti platforma trumpu horizontaliu grioveliu padalinta į dvi dalis. Ant platformos kiekvienoje pusėje išgraviruotas tinklelis. Kiekvienas tinklelis yra padalintas į devynis didelius kvadratus. Didelė aikštė viduryje yra skaičiavimo kambarys. Mikroorganizmai skaičiuojami skaičiavimo kameroje.
Skaičiavimo kambario mastelis paprastai turi dvi specifikacijas: viena yra ta, kad didelis kvadratas yra padalintas į 16 vidurinių kvadratų, o kiekvienas vidurinis kvadratas yra padalintas į 25 mažus kvadratus (Ⅷ-2 pav.); kitas yra didelis kvadratas. Kvadratas padalintas į 25 vidurinius kvadratus, o kiekvienas vidurinis kvadratas padalintas į 16 mažų kvadratų (Ⅷ-1, C pav.). Bet nesvarbu, kokia yra skaičiavimo lenta, mažų kvadratų skaičius kiekviename dideliame kvadrate yra vienodas, tai yra 16 × 25=400 mažų kvadratų.
Kiekvieno didelio kvadrato kraštinės ilgis yra 1 mm, o kiekvieno didelio kvadrato plotas yra 1 mm2. Uždengus dengiamąjį stiklą aukštis tarp slankiojančio stiklo ir dengiamojo stiklo yra 0,1 mm, taigi skaičiavimo kameros tūris yra 0,1 mm3.
Skaičiuodami paprastai suskaičiuokite bendrą bakterijų skaičių penkiuose viduriniuose kvadratuose, tada gaukite vidutinę kiekvieno vidurinio kvadrato vertę, tada padauginkite iš 16 arba 25, kad gautumėte bendrą bakterijų skaičių dideliame kvadrate, o tada konvertuokite į bendras bakterijų skaičius 1 ml bakterijų tirpalo.
Laboratorinė įranga
Hemocitometras, mikroskopas, dengiantis stiklelis, sterilus kapiliaras;
Eksperimentinės medžiagos
Saccharomyces cerevisiae suspensija
Eksperimentinė procedūra (tiesioginio mikroskopinio skaičiavimo metodas)
1. skiedimas
Tinkamai atskieskite Saccharomyces cerevisiae suspensiją. Jei bakterijų tirpalas nėra tirštas, jo skiesti nereikia.
2. Mikroskopinis skaičiavimo kambarys
Prieš pridėdami mėginius, atlikite skaičiavimo plokštelės skaičiavimo kameros mikroskopinį patikrinimą. Jei yra nešvarumų, prieš skaičiuojant jį reikia nuvalyti.
3. pridėti pavyzdį
Uždenkite švarią ir sausą hemocitometro plokštelę dengiamuoju stiklu, o po to steriliu siauros burnos lašintuvu nulašinkite nedidelį lašelį atskiesto Saccharomyces cerevisiae tirpalo nuo dengiamojo stiklo krašto (ne per daug), kad bakterijų tirpalas yra arti tarpo išilgai tarpo. Kapiliarinis osmosas pats patenka į skaičiavimo kamerą, o bendroji skaičiavimo kamera gali būti užpildyta bakteriniu skysčiu. Būkite atsargūs, kad nebūtų oro burbuliukų.
4. mikroskopo skaičius
Pailsėję 5 minutes, padėkite hemocitometrą ant mikroskopo scenos, pirmiausia naudokite mažos galios lęšį, kad surastumėte skaičiavimo kameros vietą, o tada skaičiavimui perjunkite į didelės galios objektyvą. Jei prieš skaičiuojant nustatoma, kad bakterijų tirpalas yra per tirštas arba per plonas, prieš skaičiuojant būtina iš naujo sureguliuoti skiedimą. Bendram mėginio praskiedimui reikia apie
Tinka 5-10 langeliai. Kiekviena skaičiavimo kamera parenka bakterijas 5 viduriniuose tinkleliuose (pasirinktinai 4 kampai ir centrinės grotelės) skaičiavimui. Bakterijos tinklelio linijoje paprastai skaičiuojamos tik viršutinėje ir dešinėje eilutėse. Mielės pumpurų atsiradimo atveju, kai pumpuro kūno dydis siekia pusę motininės ląstelės, suskaičiuokite dvi bakterijas. Suskaičiuokite mėginį, kad apskaičiuotumėte bakterijų kiekį mėginyje pagal dviejose skaičiavimo kamerose suskaičiuotas vertes.
5. Hemocitometro valymas
Po naudojimo išskalaukite kraujo kūnelių skaičiavimo plokštelę ant maišytuvo vandens srove, neplaukite kietais daiktais, o po plovimo išdžiovinkite patys arba plaukų džiovintuvu. Mikroskopinis tyrimas, stebėkite, ar kiekvienoje ląstelėje nėra likusių bakterijų ar kitų nuosėdų. Jei jis nėra švarus, jį reikia plauti kelis kartus, kol jis bus švarus.
