Nebrangus fluorescencinis ir šviesaus lauko mikroskopo dizainas
Fluorescencinė mikroskopija yra metodas, naudojamas vizualizuoti
Šiame vadove apžvelgsiu fluorescencinės mikroskopijos pagrindus ir kaip sukurti tris skirtingus nebrangius fluorescencinius mikroskopus. Šios sistemos paprastai kainuoja tūkstančius dolerių, tačiau pastaruoju metu buvo stengiamasi padaryti jas labiau prieinamas. Čia pateikiami dizainai naudoja išmanųjį telefoną, DSLR ir USB mikroskopą. Visi šie dizainai taip pat gali būti naudojami kaip šviesaus lauko mikroskopai.
1 veiksmas: fluorescencinės mikroskopijos apžvalga
Norėdami suprasti pagrindines fluorescencinės mikroskopijos sąvokas, įsivaizduokite tankų mišką naktį su medžiais, gyvūnais, krūmais ir kitais gyvais miškais. Jei į mišką pašviesite deglą, pamatysite visas šias struktūras ir sunkiai įsivaizduosite konkrečius gyvūnus ar augalus. Tarkime, kad jums įdomu tik pamatyti mėlynių krūmus miške. Norėdami tai padaryti, jūs mokote ugniagesį, kad jį trauktų tik mėlynių krūmai, kad pažvelgus į mišką užsidegtų tik mėlynių krūmai. Galima sakyti, kad jūs naudojate ugniagesius mėlynių krūmams žymėti, kad miške matytumėte mėlynių statinius.
Pagal šią analogiją miškas reprezentuoja visą pavyzdį, mėlynių krūmai – struktūras, kurias norite vizualizuoti (pvz., konkrečias ląsteles arba tarpląstelinius organelius), o ugniažolės yra fluorescenciniai junginiai. Vien tik deglo apšvietimas be ugniažolių yra panašus į šviesaus lauko mikroskopiją.
Kitas žingsnis – suprasti pagrindinę fluorescencinių junginių (dar vadinamų fluoroforais) funkciją. Fluoroforai iš tikrųjų yra maži objektai (nano skalė), skirti sujungti konkrečias pavyzdžio struktūras. Jie sugeria siaurą šviesos bangos ilgių diapazoną ir vėl skleidžia kitą šviesos bangos ilgį. Pavyzdžiui, fluoroforas gali sugerti mėlyną šviesą (ty fluoroforą sužadina mėlyna šviesa) ir vėl skleisti žalią šviesą. Paprastai tai apibendrinama sužadinimo ir emisijos spektruose (aukščiau). Šios diagramos rodo fluoroforo sugertos šviesos bangos ilgį ir fluoroforo skleidžiamos šviesos bangos ilgį.
Mikroskopo konstrukcija labai panaši į įprasto šviesaus lauko mikroskopo dizainą, tačiau yra du pagrindiniai skirtumai. Pirma, mėginį apšviečianti šviesa turi būti tokio bangos ilgio, kuris sužadina fluoroforą (anksčiau pateiktame pavyzdyje šviesa yra mėlyna). Antra, mikroskopui tereikia surinkti skleidžiamą šviesą (žalią šviesą), tuo pačiu blokuojant mėlyną šviesą. Taip yra todėl, kad mėlyna šviesa yra visur, bet žalia šviesa sklinda tik iš konkrečių mėginio struktūrų. Norėdami blokuoti mėlyną šviesą, mikroskopai paprastai turi vadinamąjį ilgo pralaidumo filtrą, kuris leidžia žaliai šviesai prasiskverbti be mėlynos šviesos. Kiekvienas ilgojo dažnio filtras turi ribinį bangos ilgį. Jei šviesos bangos ilgis yra ilgesnis už ribinį bangos ilgį, ji gali prasiskverbti pro filtrą. Iš čia ir kilo pavadinimas „ilgas leidimas“. Trumpesni bangos ilgiai blokuojami.
2 veiksmas: mikroskopo modeliavimas optine optika
Tai papildomas žingsnis prie pagrindinių mikroskopo projektavimo principų. Nereikia kurti fluorescencinio mikroskopo, todėl galite jį praleisti, jei nenorite gilintis į optiką.
Tiek šviesaus lauko, tiek fluorescenciniai mikroskopai gali būti modeliuojami naudojant spindulių optiką. Pagrindinė spindulinės optikos prielaida yra ta, kad šviesa elgiasi panašiai kaip šviesa, sklindanti nuo šviesos šaltinio. Apsižvalgę kambaryje matote saulės šviesą už lango arba elektros lemputę. Tada šviesą sugeria arba atspindi patalpoje esantys objektai. Dalis atsispindėjusios šviesos verčia ją nukreipti į jūsų akis. Jei objektas yra apšviestas, galite įsivaizduoti, kad kiekvienas objekto taškas skleidžia šviesą visomis kryptimis (aukščiau). Lęšis, kaip ir mūsų akių lęšis, sufokusuoja šviesą į tašką, kad galėtume matyti objektą. Be objektyvo šviesa toliau keliauja į išorę ir nesudaro vaizdo.
Taigi, kaip sukurti optines sistemas, kurios padidina mažus objektus? Norint suprasti dizainą, iš tikrųjų reikia žinoti tik dvi lygtis: plono lęšio vaizdo ir padidinimo lygtis:
1/f=1/si + 1/so
M=-si/so
f yra objektyvo židinio nuotolis. Trumpesnis židinio nuotolis reiškia, kad objektyvas turi didesnę fokusavimo galią.
Tas pats pasakytina apie objekto atstumą; atstumas tarp objektyvo ir objekto (pvz., medžio).
si yra vaizdo atstumas; atstumas tarp objektyvo ir vaizdo formavimo vietos
M yra padidinimas; kokio dydžio vaizdas yra objekto atžvilgiu. Mikroskopams norime padidinti padidinimą.
Norėdami gauti visą pamoką apie plonų lęšių lygtį, žiūrėkite šį „Khan Academia“ vaizdo įrašą. Aukščiau esančiame gif matote, kad atstumas, kuriuo objektas juda arčiau objektyvo, padidina vaizdo atstumą, o tai padidina padidinimą. Vertikali linija su dviem rodyklėmis nurodo objektyvą.
