Nebrangi fluorescencija ir šviesaus lauko mikroskopo dizainas
Šiame vadove apžvelgsiu pagrindinius fluorescencinės mikroskopijos principus ir kaip sukurti tris skirtingus nebrangius fluorescencinius mikroskopus. Šios sistemos paprastai kainuoja tūkstančius dolerių, tačiau pastarosios pastangos padėjo jas lengviau įsigyti. Dizainas, kurį pristatau čia, naudoja išmaniuosius telefonus, DSLR ir USB mikroskopus. Visi šie dizainai taip pat gali būti naudojami kaip atviro lauko mikroskopai.
1 veiksmas: fluorescencinės mikroskopijos apžvalga
Norėdami suprasti pagrindines fluorescencinės mikroskopijos sąvokas, įsivaizduokite tankius miškus, medžius, gyvūnus, krūmus ir kitus miškus, kurie gyvena miške naktį. Jei į mišką pašviesite žibintuvėlį, pamatysite visas šias struktūras ir sunku įsivaizduoti konkrečius gyvūnus ar augalus. Darant prielaidą, kad jus domina tik šilauogių krūmai miške. Norint tai pasiekti, ugniagesius reikia išmokyti, kad jas trauktų tik mėlynių krūmai, kad pažvelgus į mišką šviestų tik mėlynių krūmai. Galima sakyti, kad šilauogių krūmus pažymėjote ugniagesiais, todėl miške matosi mėlynių statiniai.
Pagal šią analogiją miškas reiškia visą pavyzdį, mėlynių krūmas – struktūrą, kurią norite vizualizuoti (pvz., konkrečias ląsteles ar tarpląstelinius organelius), o ugniažolės yra fluorescenciniai junginiai. Situacija fotografuojant vien žibintuvėliu be ugniagesių panaši į šviesaus lauko mikroskopą.
Kitas žingsnis – suprasti pagrindines fluorescencinių junginių (dar vadinamų fluoroforais) funkcijas. Fluorescenciniai klasteriai iš tikrųjų yra maži objektai (nano skalė), skirti sujungti konkrečias pavyzdžio struktūras. Jie sugeria siauro bangos ilgio diapazono šviesą ir vėl skleidžia kito bangos ilgio šviesą. Pavyzdžiui, fluorescencinė grupė gali sugerti mėlyną šviesą (ty fluorescencinė grupė sužadinama mėlyna šviesa) ir vėl skleisti žalią šviesą. Paprastai tai apibendrinama naudojant sužadinimo ir emisijos spektrus (kaip parodyta aukščiau esančiame paveikslėlyje). Šiose diagramose rodomi fluoroforo sugertos šviesos bangos ilgiai ir fluoroforo skleidžiamos šviesos bangos ilgiai.
Mikroskopo konstrukcija labai panaši į įprasto atvirojo lauko mikroskopo dizainą, tačiau skiriasi du pagrindiniai skirtumai. Pirma, mėginį apšviečianti šviesa turi būti sužadintos fluorescencinės grupės bangos ilgio (anksčiau pateiktame pavyzdyje šviesa yra mėlyna). Antra, mikroskopui tereikia surinkti skleidžiamą šviesą (žalią šviesą), tuo pačiu blokuojant mėlyną šviesą. Taip yra todėl, kad mėlyna šviesa yra visur, bet žalia šviesa sklinda tik iš konkrečių mėginio struktūrų. Norėdami blokuoti mėlyną šviesą, mikroskopai paprastai turi vadinamąjį ilgo pralaidumo filtrą, kuris leidžia žaliai šviesai prasiskverbti be mėlynos šviesos. Kiekvienas ilgo pralaidumo filtras turi ribinį bangos ilgį. Jei šviesos bangos ilgis yra didesnis už ribinį bangos ilgį, ji gali praeiti per filtrą. Todėl pavadinimas yra „Long Distance Pass“. Trumpesni bangos ilgiai blokuojami.
2 veiksmas: mikroskopo modeliavimas naudojant optinę optiką
Tai yra papildomas žingsnis kuriant pagrindinį mikroskopo principą. Nereikia statyti fluorescencinio mikroskopo, todėl jei nenorite gilintis į optiką, galite jo praleisti.
Tiek šviesaus lauko, tiek fluorescenciniai mikroskopai gali būti modeliuojami naudojant spindulių optinius įrenginius. Pagrindinė spindulinės optikos prielaida yra ta, kad šviesos elgesys yra panašus į šviesos, sklindančios nuo šviesos šaltinio. Apsidairę po kambarį, už lango pamatysite saulės šviesą arba lemputės atneštą šviesą. Tada šviesą sugeria arba atspindi patalpoje esantys objektai. Atsispindėjusi šviesa bus nukreipta į jūsų akis. Jei objektas yra apšviestas, galite įsivaizduoti, kad kiekvienas objekto taškas skleidžia šviesą visomis kryptimis (kaip parodyta aukščiau esančiame paveikslėlyje). Lęšis, kaip ir mūsų akių lęšis, sufokusuoja šviesą į tašką, kad galėtume matyti objektą. Be objektyvo šviesa toliau sklinda į išorę ir nesudaro vaizdo.
