Kuo fluorescencinė mikroskopija skiriasi nuo įprastos mikroskopijos
Neseniai bandžiau padaryti keletą šaldytų pelių pjūvių, o dabar turiu naudoti fluorescencinį mikroskopą, kad pamatyčiau, ar mano suleisto viruso yra norimoje smegenų srityje. Kai kuriuos pagrindinius fluorescencinės mikroskopijos principus reikia trumpai išstudijuoti, ir aš jais pasidalinsiu čia.
Fluorescencinis mikroskopas naudoja ultravioletinę šviesą kaip šviesos šaltinį, kad apšviestų tiriamą objektą, todėl objektas skleidžia šviesos šaltinį ir tada stebi objektą po mikroskopu. Daugiausia naudojamas imunofluorescencinėms ląstelėms, jį sudaro šviesos šaltinis, filtro plokštelių sistema ir optinė sistema, skirta stebėti mėginio fluorescencinį vaizdą padidinant okuliarą ir objektyvo lęšį. Pažiūrėkime, kuo skiriasi šis fluorescencinis mikroskopas nuo įprasto optinio mikroskopo.
1. Kalbant apie apšvietimo būdus
Fluorescencinio mikroskopo apšvietimo metodas paprastai naudojamas krintančio pluošto metodu, o tai reiškia, kad šviesos šaltinis yra projektuojamas į tiriamąjį pavyzdį per objektyvo lęšį.
2. Kalbant apie skiriamąją gebą
Fluorescencinėje mikroskopijoje kaip šviesos šaltinis naudojama ultravioletinė šviesa, kurios bangos ilgis yra palyginti trumpas, bet skiriamoji geba didesnė nei įprasti optiniai mikroskopai.
3. Filtro skirtumai
Fluorescenciniame mikroskope naudojami du specialūs filtrai, vienas priešais šviesos šaltinį, kad išfiltruotų matomą šviesą, o kitas tarp objektyvo ir okuliaro, kad išfiltruotų ultravioletinę šviesą, kuri gali apsaugoti akis.
Fluorescencinė mikroskopija taip pat yra optinio mikroskopo rūšis, daugiausia dėl to, kad fluorescencinės mikroskopijos sužadintos bangos ilgis yra trumpas, todėl skiriasi fluorescencinės mikroskopijos ir įprastos mikroskopijos struktūra ir naudojimas. Dauguma fluorescencinių mikroskopų turi gerą silpnos šviesos fiksavimo funkciją, todėl jų vaizdavimo galimybės taip pat yra geros esant ypač silpnai fluorescencijai. Be to, pastaraisiais metais nuolat tobulėjant fluorescencinei mikroskopijai, triukšmas taip pat gerokai sumažėjo. Todėl pritaikoma vis daugiau fluorescencinių mikroskopų.
Žinios, susijusios su dviejų fotonų fluorescencine mikroskopija
Pagrindinis dviejų fotonų sužadinimo principas yra tas, kad esant dideliam fotonų tankiui, fluorescencinės molekulės vienu metu gali sugerti du ilgo bangos ilgio fotonus, o po trumpo vadinamosios sužadintos būsenos gyvavimo laikotarpio išspinduliuoti trumpesnio bangos ilgio fotoną; Jo poveikis yra toks pat, kaip naudojant fotoną, kurio bangos ilgis yra pusė ilgosios bangos ilgio, sužadinant fluorescencines molekules. Dviejų fotonų sužadinimui reikalingas didelis fotonų tankis, o norint nepažeisti ląstelių, dviejų fotonų mikroskope naudojamas didelės energijos režimu užrakintas impulsinis lazeris. Šio tipo lazerių skleidžiamas lazeris turi didelę didžiausią energiją ir mažą vidutinę energiją, jo impulso plotis siekia tik 100 femtosekundžių, o dažnis – iki 80–100 megahercų. Naudojant didelės skaitmeninės diafragmos objektyvą impulsinio lazerio fotonams sufokusuoti, fotonų tankis objektyvo židinio taške yra didžiausias, o dviejų fotonų sužadinimas vyksta tik objektyvo židinio taške. Todėl dviejų fotonų mikroskopui nereikia konfokalinių skylučių, o tai pagerina fluorescencijos aptikimo efektyvumą.
Kalbant apie bendruosius fluorescencijos reiškinius, dėl mažo sužadinimo fotonų tankio fluorescencinė molekulė vienu metu gali sugerti tik vieną fotoną, o po to per spinduliavimo perėjimą, vadinamą vieno fotono fluorescencija, išspinduliuoti vieną fluorescencinį fotoną. Fluorescencinio sužadinimo procese, naudojant lazerį kaip šviesos šaltinį, gali atsirasti dviejų fotonų ar net daugiafotonų fluorescencijos reiškinių. Šiuo metu naudojamas sužadinimo šviesos šaltinis yra didelio intensyvumo, o fotonų tankis atitinka reikalavimą, kad fluorescencinės molekulės vienu metu sugertų du fotonus. Naudojant tipinį lazerį kaip sužadinimo šviesos šaltinį, fotonų tankio vis dar nepakanka, kad būtų sukurtas dviejų fotonų sugerties reiškinys. Paprastai naudojami femtosekundiniai impulsiniai lazeriai, kurių momentinė galia gali siekti megavatų lygį. Todėl dviejų fotonų fluorescencijos bangos ilgis yra trumpesnis nei sužadinimo, o tai prilygsta efektui, kurį sukelia pusės sužadinimo bangos ilgio sužadinimas.
