Konfokalinės lazerinės mikroskopijos savybės ir taikymas
Lazerinis skenuojantis konfokalinis mikroskopas (LSCM) yra mikroskopo tipas, sukurtas remiantis konjuguoto fokusavimo technologija, ty lazerio šviesos šaltiniu, bandomu mėginiu ir detektoriaus konjuguota padėtimi.
Fundamentalus
Bendruosiuose mikroskopuose objektyvo lęšio židinio plokštuma sutampa su detektoriumi taip, kad stebima vaizdo plokštuma būtų izoliuota nuo gretimos ašinės plokštumos, o konfokaliniuose mikroskopuose mėginys apšviečiamas naudojant difrakcijos ribotą šviesos tašką ir Šis izoliacijos efektas pasiekiamas naudojant smeigtuko skylę surinkimo šviesos kelyje taškinio konjugato židinio taške, kad būtų galima filtruoti išsklaidytą šviesą ir pagerinti skiriamąją gebą.
Vaizdavimo funkcijos
Tik šviesa, atsispindėjusi iš konjuguoto mėginio sluoksnio, gali praeiti pro mažą skylę surinkimo šviesos kelyje, o likusius nereikšmingus mėginio sluoksnio atspindžius blokuoja maža skylė. Tai gali žymiai padidinti skiriamąją gebą. Žemiau parodytas to paties storio mėginio daugiamatės fluorescencinės mikroskopijos ir konfokalinės mikroskopijos palyginimas. Kai vaizdų serija daroma skirtingose židinio plokštumose, galima sukurti tai, kas paprastai vadinama „z-stack“, ir šis vaizdas parodo konfokalinės mikroskopijos teikiamą skiriamąją gebą ir kontrasto padidėjimą bei pagrindines šio padidėjimo priežastis. Ištyrus vaizdą krūvos viršuje, kai vaizdo plokštuma virš audinio, fluorescenciniame vaizde matoma daug išsklaidytos šviesos, o konfokalinis vaizdas atrodo juodas. Šis PSF sumažėjimas ašine kryptimi yra tiesiogiai atsakingas už skiriamosios gebos skirtumą, pastebėtą optinėje sąsajoje z kamino viduryje.
Kitas lazerinio skenavimo konfokalinės mikroskopijos bruožas yra tai, kad tai yra skenuojančio vaizdo technologija. Tradicinė plataus lauko apšvietimo technologija apšviečia visą pavyzdį, todėl vaizdas gali būti užfiksuotas tiesiogiai plika akimi arba detektoriumi, tačiau LSCM nuskaitymui ir vaizdavimui per pavyzdį naudoja spindulį arba kelis sufokusuotus pluoštus, o gautas vaizdas yra vadinama optine sekcija. Toliau parodytas skirtumas tarp tradicinio plataus lauko apšvietimo metodo ir lazerinio skenavimo konfokalinio apšvietimo metodo.
Todėl praktinis šiuolaikinio konfokalinio mikroskopo darbo metodas parodytas paveikslėlyje žemiau. Lazerio skleidžiama sužadinimo šviesa praeina per dichroinį veidrodį ir skenuoja mėginio x ir y kryptimis per vibruojančių veidrodžių porą. Mėginio sužadinimas (arba atspindys) Šviesa patenka į PMT detektorių per skylutę ir įrašoma, o įrašytas nuskaitymo vaizdas atkuriamas kompiuteriu, kad būtų gautas tikrasis mėginio vaizdas.
