Fluorescencinių mikroskopų ir įprastų šviesos mikroskopų skirtumai ir charakteristikos
Fluorescencinis mikroskopas skiriasi nuo įprasto optinio mikroskopo tuo, kad jis nestebi mėginių apšviečiant įprastus šviesos šaltinius. Vietoj to, jis naudoja tam tikrą šviesos bangos ilgį (dažniausiai ultravioletinę šviesą, mėlyną violetinę šviesą), kad sužadintų fluorescencines medžiagas, esančias mėginio viduje po mikroskopu, todėl jos skleidžia fluorescenciją. Todėl šviesos šaltinio vaidmuo fluorescenciniame mikroskope yra ne tiesioginis apšvietimas, o kaip energijos šaltinis, sužadinantis fluorescencines medžiagas mėginio viduje. Priežastis, kodėl mes galime stebėti mėginius, yra ne dėl šviesos šaltinio apšvietimo, o dėl fluorescencijos reiškinio, kurį parodo bandinio viduje esančios fluorescencinės medžiagos, sugėrusios sužadintos šviesos energiją. Iš to matyti, kad fluorescencinės mikroskopijos ypatybė daugiausia yra ta, kad jos šviesos šaltinis gali tiekti didelį sužadinimo šviesos kiekį tam tikrame bangos ilgio diapazone, kad bandinyje esančios fluorescencinės medžiagos galėtų gauti reikiamą sužadinimo šviesos intensyvumą. Tuo pačiu metu fluorescenciniai mikroskopai turi turėti atitinkamas filtrų sistemas. Fluorescencinis mikroskopas yra pagrindinė fluorescencinių audinių chemijos priemonė. Jį sudaro pagrindiniai komponentai, tokie kaip itin aukštos įtampos šviesos šaltinis, filtrų sistema (įskaitant sužadinimo ir slopinimo filtrų plokštes), optinė sistema ir fotografavimo sistema. Jis naudoja tam tikro bangos ilgio šviesą, kad sužadintų mėginį ir skleistų fluorescenciją.
1. Fluorescencinio sužadinimo metodai: Pagal šviesos bangų ilgių diapazoną yra dviejų tipų: UV sužadinimo metodas (naudojant ultravioletinį apšvietimą) ir BV sužadinimo metodas (naudojant mėlyną violetinę šviesą). Taikant UV sužadinimo metodą, sužadinimui naudojama artima ultravioletinė šviesa, trumpesnė nei 400 nm. Šis metodas neturi matomos sužadinimo šviesos, todėl stebima fluorescencija rodo būdingą dažų fluorescenciją, todėl lengva atskirti specifinę bandinio fluorescenciją nuo foninio audinio savaiminės fluorescencijos.
2. BV sužadinimo metodas: jis apima sužadinimą nuo ultravioletinės iki mėlynos šviesos, kurių centras yra 404 nm ir 434 nm. Šis metodas naudoja mėlyną šviesą bandiniui apšvitinti, todėl fluorescencijos stebėjimo sistemos ribinis filtras turi naudoti filtrą, kuris gali visiškai blokuoti mėlyną šviesą ir visiškai praleisti reikiamą žalią ir geltoną fluorescenciją. Fluorescenciniai pigmentai, naudojami fluorescuojančių antikūnų metodui. Didžiausias sužadinimo šviesos sugerties bangos ilgis ir didžiausias fluorescencijos emisijos bangos ilgis yra santykinai artimi, todėl BV sužadinimo metodu naudojamas filtras turi naudoti aštraus pjūvio filtrą. Šis metodas gali naudoti mėlyną šviesą kaip sužadinimo šviesą, todėl fluorescencinių pigmentų sugerties efektyvumas yra didelis ir galima gauti ryškesnius vaizdus. Trūkumas yra tas, kad fluorescencija žemiau 500 nm nesimato, o esant aukštesnei nei 500 nm fluorescencijai, visas vaizdas atrodo geltonas. Taikant fluorescuojančių antikūnų metodą, specifiškumą dažniausiai lemia tik fluorescenciniams pigmentams būdinga spalva, todėl kalbant apie subtilų specifiškumą, dažnai reikšmingą įtaką turi aukščiau paminėti BV sužadinimo metodo trūkumai.
