Skirtumas tarp įprasto mikroskopo ir fluorescencinio mikroskopo
Fluorescenciniai mikroskopai naudoja ultravioletinę šviesą kaip šviesos šaltinį, kad apšvitintų tiriamą objektą, kad objektas skleistų šviesą, o tada stebėkite objektą po mikroskopu. Jis daugiausia naudojamas imunofluorescencinėms ląstelėms. Jį daugiausia sudaro šviesos šaltinis, filtro plokštelių sistema ir optinė sistema, skirta stebėti fluorescencinį mėginio vaizdą per okuliaro ir objektyvo padidinimą. Pažiūrėkime, kuo skiriasi šis fluorescencinis mikroskopas nuo paprasto optinio mikroskopo.
1. Kalbant apie apšvietimo būdus
Fluorescencinio mikroskopo apšvietimo metodas paprastai yra episkopinis, t. y. šviesos šaltinis per objektyvą projektuojamas ant bandinio.
2. Kalbant apie skiriamąją gebą
Fluorescenciniai mikroskopai naudoja ultravioletinę šviesą kaip šviesos šaltinį. Bangos ilgis yra palyginti trumpas, tačiau skiriamoji geba yra didesnė nei įprastų optinių mikroskopų.
3. Filtro skirtumas
Fluorescenciniame mikroskope naudojami du specialūs filtrai, kurie naudojami prieš šviesos šaltinį matomai šviesai filtruoti, o tarp objektyvo lęšio ir okuliaro – ultravioletiniams spinduliams, kurie gali apsaugoti žmogaus akis.
Fluorescencinis mikroskopas taip pat yra savotiškas optinis mikroskopas, daugiausia todėl, kad fluorescencinio mikroskopo sužadinamas bangos ilgis yra trumpas, todėl skiriasi fluorescencinio mikroskopo ir įprasto mikroskopo struktūra ir naudojimas. Dauguma fluorescencinių mikroskopų turi gerą funkciją fiksuoti silpną šviesą, todėl esant ypač silpnai fluorescencijai, jų vaizdavimo galimybės taip pat yra geros. Kartu su nuolatiniu fluorescencinių mikroskopų tobulėjimu pastaraisiais metais, triukšmas taip pat labai sumažėjo. Todėl vis daugiau naudojami fluorescenciniai mikroskopai.
Žinios apie dviejų fotonų fluorescencinę mikroskopiją
Pagrindinis dviejų fotonų sužadinimo principas yra toks: esant dideliam fotonų tankiui, fluorescencinės molekulės gali vienu metu sugerti du ilgos bangos fotonus, o po trumpo vadinamojo sužadintos būsenos gyvavimo laiko išspinduliuoti trumpesnės bangos fotoną. . ; efektas yra toks pat, kaip naudojant fotoną, kurio bangos ilgis yra pusė ilgosios bangos ilgio, sužadinant fluorescencinę molekulę. Dviejų fotonų sužadinimui reikalingas didelis fotonų tankis. Kad nebūtų pažeistos ląstelės, dviejų fotonų mikroskopijoje naudojami didelės energijos režimu blokuojami impulsiniai lazeriai. Šio lazerio skleidžiamas lazeris turi didelę didžiausią energiją ir mažą vidutinę energiją, jo impulso plotis siekia tik 100 femtosekundžių, o dažnis gali siekti 80–100 megahercų. Naudojant didelės skaitinės diafragmos objektyvą impulsinio lazerio fotonams sufokusuoti, fotonų tankis objektyvo židinio taške yra didžiausias, o dviejų fotonų sužadinimas vyksta tik objektyvo židinio taške, todėl dviejų fotonų mikroskopui nereikia konfokalinės skylutės, o tai pagerina fluorescencijos aptikimo efektyvumą.
Kalbant apie bendruosius fluorescencijos reiškinius, dėl mažo sužadinimo šviesos fotonų tankio fluorescencinė molekulė vienu metu gali sugerti tik vieną fotoną, o tada spinduliuojantis perėjimas, kuris yra vieno fotono fluorescencija, išspinduliuoja fluorescencinį fotoną. Fluorescencinio sužadinimo procese, naudojant lazerį kaip šviesos šaltinį, gali atsirasti dviejų ar net kelių fotonų fluorescencija. Šiuo metu naudojamas sužadinimo šviesos šaltinio intensyvumas yra didelis, o fotonų tankis atitinka fluorescencinių molekulių, vienu metu sugeriančių du fotonus, reikalavimus. Naudojant bendrą lazerį kaip sužadinimo šviesos šaltinį, fotonų tankio vis dar nepakanka, kad būtų sukurtas dviejų fotonų sugerties reiškinys. Dažniausiai naudojamas femtosekundinis impulsinis lazeris, kurio momentinė galia gali siekti megavatų eilę. Todėl dviejų fotonų fluorescencijos bangos ilgis yra trumpesnis nei sužadinimo šviesos bangos ilgis, o tai yra lygiavertis efektui, kurį sukelia sužadinimas esant pusei sužadinimo bangos ilgio.
Dviejų fotonų fluorescencinė mikroskopija turi daug privalumų:
1) Ilgos bangos šviesa yra mažiau veikiama sklaidos nei trumpos bangos šviesa ir lengvai prasiskverbia į mėginį;
2) Fluorescencinės molekulės, esančios už židinio plokštumos, nėra sužadintos, kad daugiau sužadinimo šviesos galėtų pasiekti židinio plokštumą, kad sužadinimo šviesa galėtų prasiskverbti į gilesnius mėginius;
3) ilgosios bangos artimųjų infraraudonųjų spindulių šviesa yra mažiau toksiška ląstelėms nei trumpabangioji šviesa;
4) Kai mėginiams stebėti naudojamas dviejų fotonų mikroskopas, fotobalinimas ir fototoksiškumas atsiranda tik židinio plokštumoje. Todėl dviejų fotonų mikroskopija yra tinkamesnė nei vieno fotono mikroskopija storiems mėginiams stebėti, gyvoms ląstelėms stebėti arba dėmių fotobalinimo eksperimentams.
Žinios apie konfokalinę fluorescencinę mikroskopiją
Pagrindinis konfokalinės fluorescencinės mikroskopijos principas: bandiniui apšvitinti naudojamas taškinis šviesos šaltinis, o židinio plokštumoje susidaro aiškiai apibrėžta nedidelė šviesos dėmė. sudarytas iš skirstytuvų. Spindulio skirstytuvas siunčia fluorescenciją tiesiai į detektorių. Priešais šviesos šaltinį ir detektorių yra skylutė, atitinkamai vadinama apšvietimo smeigtuku ir aptikimo skylute. Jų geometrinis dydis yra toks pat, apie 100-200nm; Palyginti su šviesos tašku židinio plokštumoje, jie abu yra sujungti, tai yra, šviesos taškas praeina per lęšių seriją ir galiausiai gali būti sufokusuotas į apšvietimo skylutę ir aptikimo skylutę tuo pačiu metu. Tokiu būdu šviesa iš židinio plokštumos gali būti suartinta aptikimo angos srityje, o išsklaidyta šviesa iš viršaus arba žemiau židinio plokštumos yra užblokuota už aptikimo angos ir negali būti vaizduojama. Lazeris nuskaito mėginį taškas po taško, o fotodaugiklio vamzdelis, aptikęs skylutę, taip pat taškas po taško gauna atitinkamo šviesos taško konfokalinį vaizdą, kuris paverčiamas skaitmeniniu signalu ir perduodamas į kompiuterį, o galiausiai sujungiamas į aiškų vaizdą. konfokalinis visos židinio plokštumos vaizdas ekrane .
Kiekvienas židinio plokštumos vaizdas iš tikrųjų yra optinis bandinio skerspjūvis. Šis optinis skerspjūvis visada turi tam tikrą storį, dar vadinamą optiniu plonu pjūviu. Kadangi šviesos intensyvumas židinio taške yra daug didesnis nei ne židinio taške, o ne židinio plokštumos šviesa filtruojama skylute, konfokalinės sistemos lauko gylis yra maždaug lygus nuliui, o skenavimas palei Z -ašyje galima realizuoti optinę tomografiją, formuojant Stebėkite dvimatę optinę pjūvį sufokusuotoje mėginio vietoje. Sujungus XY plokštumos (židinio plokštumos) skenavimą su Z ašies (optinės ašies) skenavimu, trimatį mėginio vaizdą galima gauti kaupiant dvimačius ištisinių sluoksnių vaizdus ir apdorojus specialia kompiuterine programine įranga.
Tai reiškia, kad aptikimo skylutė ir šviesos šaltinio skylutė visada yra sufokusuotos į tą patį tašką, todėl fluorescencija, sužadinta už židinio plokštumos, negali patekti į aptikimo angą.
Paprasta lazerinio konfokalinio veikimo principo išraiška yra ta, kad jis naudoja lazerį kaip šviesos šaltinį ir, remiantis tradiciniu fluorescenciniu mikroskopu, prideda lazerinį skenavimo įrenginį ir konjuguoto fokusavimo įtaisą ir yra skaitmeninio vaizdo gavimo ir vaizdo gavimo sistema. apdorojimas naudojant kompiuterio valdymą.
