Skirtumas tarp fluorescencinio mikroskopo ir įprasto mikroskopo
1. Pažiūrėkite į apšvietimo būdą
Fluorescencinio mikroskopo apšvietimo metodas paprastai yra epi tipo, ty šviesos šaltinis yra dedamas ant bandinio per objektyvą.
2. Pažiūrėkite į rezoliuciją
Fluorescenciniuose mikroskopuose kaip šviesos šaltinis naudojama ultravioletinė šviesa, kurios bangos ilgis yra palyginti trumpas, tačiau skiriamoji geba yra didesnė nei įprastų optinių mikroskopų.
3, filtro skirtumas
Fluorescenciniame mikroskope naudojami du specialūs filtrai, naudojami priešais šviesos šaltinį matomai šviesai filtruoti, o tarp objektyvo lęšio ir okuliaro – ultravioletiniams spinduliams, kurie gali apsaugoti žmogaus akis.
Fluorescencinis mikroskopas taip pat yra optinio mikroskopo rūšis, daugiausia todėl, kad fluorescencinio mikroskopo sužadinamas bangos ilgis yra trumpas, todėl skiriasi fluorescencinio mikroskopo ir įprasto mikroskopo struktūra ir naudojimas. Dauguma fluorescencinių mikroskopų turi gerą silpnos šviesos fiksavimo funkciją. , todėl esant itin silpnai fluorescencijai, jo vaizdo gebėjimas taip pat yra geras. Kartu su nuolatiniu fluorescencinės mikroskopijos tobulėjimu pastaraisiais metais, triukšmas taip pat labai sumažėjo. Todėl vis daugiau naudojami fluorescenciniai mikroskopai.
Dviejų fotonų fluorescencinės mikroskopijos išmanymas
Pagrindinis dviejų fotonų sužadinimo principas yra toks: esant dideliam fotonų tankiui, fluorescencinės molekulės vienu metu gali sugerti du ilgos bangos fotonus, o po labai trumpo vadinamosios sužadintos būsenos gyvavimo trukmės išspinduliuoti trumpos bangos fotoną. ; efektas yra toks pat, kaip naudojant fotoną, kurio bangos ilgis yra pusė ilgosios bangos ilgio, sužadinant fluorescencinę molekulę. Dviejų fotonų sužadinimui reikalingas didelis fotonų tankis, o kad nebūtų pažeistos ląstelės, dviejų fotonų mikroskopijoje naudojami didelės energijos režimu blokuojami impulsiniai lazeriai. Šis lazeris skleidžia lazerio šviesą su didele didžiausia energija ir maža vidutine energija, kurio impulso plotis yra tik 100 femtosekundžių ir 80–100 MHz dažnis. Kai impulsinio lazerio fotonams sufokusuoti naudojamas didelės skaitmeninės diafragmos objektyvas, fotonų tankis objektyvo židinio taške yra didžiausias, o dviejų fotonų sužadinimas vyksta tik objektyvo židinio taške, todėl dviejų fotonų mikroskopui nereikia konfokalinės skylutės, o tai pagerina fluorescencijos aptikimo efektyvumą.
Esant bendram fluorescencijos reiškiniui, dėl mažo sužadinimo šviesos fotonų tankio fluorescencinė molekulė vienu metu gali sugerti tik vieną fotoną, o tada per spinduliavimo perėjimą, vadinamą vieno fotono fluorescencija, išspinduliuoti fluorescencinį fotoną. Fluorescencinio sužadinimo procese, kai šviesos šaltinis yra lazeris, gali atsirasti dviejų ar net kelių fotonų fluorescencijos reiškinys. Šiuo metu naudojamas sužadinimo šviesos šaltinio intensyvumas yra didelis, o fotonų tankis atitinka reikalavimą, kad fluorescencinė molekulė vienu metu sugertų du fotonus. Naudojant bendrą lazerį kaip sužadinimo šviesos šaltinį, fotonų tankis vis dar nėra pakankamas dviejų fotonų absorbcijai. Dažniausiai naudojamas femtosekundinis impulsinis lazeris, kurio momentinė galia gali siekti megavatų eilę. Todėl dviejų fotonų fluorescencijos bangos ilgis yra trumpesnis nei sužadinimo šviesos bangos ilgis, o tai yra lygiavertis efektui, kurį sukelia pusės sužadinimo bangos ilgio sužadinimas.
Dviejų fotonų fluorescencinė mikroskopija turi daug privalumų:
1) Ilgos bangos šviesa yra mažiau veikiama sklaidos nei trumpos bangos šviesa ir gali lengvai prasiskverbti į mėginį;
2) Fluorescencinės molekulės, esančios už židinio plokštumos, nėra sužadintos, kad daugiau sužadinimo šviesos galėtų pasiekti židinio plokštumą, kad sužadinimo šviesa galėtų prasiskverbti į gilesnius mėginius;
3) ilgosios bangos artimųjų infraraudonųjų spindulių šviesa yra mažiau toksiška ląstelėms nei trumpabangioji šviesa;
4) Žiūrint mėginius dviejų fotonų mikroskopu, fotobalinimas ir fototoksiškumas yra tik židinio plokštumoje. Todėl dviejų fotonų mikroskopija labiau tinka storiems mėginiams žiūrėti nei vieno fotono mikroskopija, gyvoms ląstelėms apžiūrėti arba fiksuoto taško fotobalinimo eksperimentams atlikti.
Konfokalinės fluorescencinės mikroskopijos išmanymas
Pagrindinis konfokalinės fluorescencinės mikroskopijos principas: naudojant taškinį šviesos šaltinį bandiniui apšviesti, židinio plokštumoje susidaro nedidelė šviesos dėmė su aiškiai apibrėžtu kontūru. sudarytas iš pluošto skirstytuvo. Spindulio skirstytuvas siunčia fluorescenciją tiesiai į detektorių. Priešais šviesos šaltinį ir detektorių yra skylutė, atitinkamai vadinama apšvietimo smeigtuku ir aptikimo skylute. Dviejų geometriniai matmenys yra vienodi, apie 100-200 nm; Palyginti su šviesos tašku židinio plokštumoje, jie abu yra sujungti, tai yra, šviesos taškas praeina per lęšių seriją ir galiausiai gali būti sufokusuotas į apšvietimo skylutę ir aptikimo skylutę tuo pačiu metu. Tokiu būdu šviesa iš židinio plokštumos gali būti sutelkta aptikimo angos diapazone, o išsklaidyta šviesa iš viršaus arba žemiau židinio plokštumos yra užblokuota iš aptikimo angos ir negali būti vaizduojama. Mėginys taškas po taško nuskaitomas lazeriu, o fotodaugiklio vamzdelis, aptikęs skylutę, taip pat taškas po taško gauna atitinkamos šviesos konfokalinį vaizdą, kuris paverčiamas skaitmeniniu signalu ir perduodamas į kompiuterį, o galiausiai sujungiamas ekraną į aiškų konfokalinį visos židinio plokštumos vaizdą. .
Kiekvienas židinio plokštumos vaizdas iš tikrųjų yra optinis bandinio skerspjūvis, o šis optinis skerspjūvis visada turi tam tikrą storį, taip pat žinomą kaip optinis pjūvis. Kadangi šviesos intensyvumas židinio taške yra daug didesnis nei ne židinio taške, o ne židinio plokštumos šviesą išfiltruoja skylutė, konfokalinės sistemos lauko gylis yra maždaug lygus nuliui, o skenavimas išilgai Z ašis gali realizuoti optinę tomografiją, sufokusuotoje mėginio vietoje sudarydama dvimatę optinę sekciją. Sujungus XY plokštumos (židinio plokštumos) skenavimą su Z ašies (optinės ašies) skenavimu, kaupiant dvimačius nuoseklių sluoksnių vaizdus ir apdorojant specialia kompiuterine programine įranga, galima gauti trimatį mėginio vaizdą.
Tai reiškia, kad aptikimo skylutė ir šviesos šaltinio skylutė visada sufokusuotos į tą patį tašką, kad fluorescencija, sužadinta už fokusavimo plokštumos, negalėtų patekti į aptikimo angą.
Paprasta konfokalinio lazerio veikimo principo išraiška yra ta, kad jis naudoja lazerį kaip šviesos šaltinį ir, remiantis tradiciniu fluorescenciniu mikroskopu, yra prijungtas lazerinis skenavimo įtaisas ir konjuguoto fokusavimo įtaisas, o skaitmeninis vaizdo gavimas ir apdorojimas. sistema valdoma kompiuteriu.
