Konfokalinio mikroskopo ir įprasto optinio mikroskopo palyginimas
Bendrasis optinis mikroskopas
Bendrasis biologinis mikroskopas susideda iš trijų dalių, būtent: ① apšvietimo sistemos, įskaitant šviesos šaltinį ir kondensatorių; ② Optinio stiprinimo sistema, kurią sudaro objektyvas ir okuliaras, yra pagrindinis mikroskopo korpusas. Siekiant pašalinti sferinę aberaciją ir chromatinę aberaciją, tiek okuliaras, tiek objektyvas yra sudaryti iš sudėtingų lęšių grupių; (3) mechaninis įtaisas, naudojamas medžiagoms tvirtinti ir patogiam stebėjimui.
Ar mikroskopo vaizdas aiškus, ar ne, priklauso ne tik nuo padidinimo, bet ir nuo mikroskopo raiškos. Rezoliucija reiškia mikroskopo (arba vietos, kur žmogaus akys yra 25 cm atstumu nuo taikinio) gebėjimą atskirti nedidelį objekto zui intervalą. Skiriamoji geba priklauso nuo šviesos bangos ilgio, diafragmos santykio ir terpės lūžio rodiklio, kuris išreiškiamas formule:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Kur: n= terpės lūžio rodiklis;=veidrodžio kampas (pavyzdžio atsidarymo kampas iki objektyvo diafragmos) ir NA= skaitmeninė diafragma. Veidrodžio kampas visada mažesnis nei 180? Todėl sina/2 zui reikšmė turi būti mažesnė nei 1.
Stiklo, naudojamo optiniams lęšiams gaminti, lūžio rodiklis yra 1,65–1,78, o naudojamos terpės lūžio rodiklis yra artimesnis stiklo lūžio rodikliui, tuo geriau. Sausam objektyvo lęšiui terpė yra oras, o diafragmos santykis paprastai yra 0.05 ~ 0,95; Alyvos lęšyje kaip terpė naudojamas kvapnus asfaltas, o objektyvo atidarymo greitis gali būti artimas 1,5.
Įprastos šviesos bangos ilgis yra 400~700 nm, taigi mikroskopo skiriamoji geba yra ne mažesnė kaip 0,2 μm, o žmogaus akies skiriamoji geba yra 0,2 mm, todėl didelis zui padidinimas, sukurtas bendras mikroskopas paprastai yra 1000X x.
Kodėl jums reikia konfokalinio mikroskopo?
1. Optinis mikroskopas buvo patobulintas mūsų didžiųjų pirmtakų pastangomis ir tobulėjimu. Tiesą sakant, įprasti mikroskopai gali mums paprastai ir greitai pateikti gražius mikroskopinius vaizdus. Tačiau įvyko įvykis, atnešęs revoliucines naujoves į šį beveik tobulą mikroskopų pasaulį, tai yra „lazerinio skenuojančio konfokalinio mikroskopo“ išradimas. Šiam naujajam mikroskopui būdinga optinė sistema, kuri išgauna vaizdo informaciją tik toje plokštumoje, kurioje sutelktas židinys, ir atkuria gautą informaciją vaizdo atmintyje keičiant židinį, kad vaizdas būtų ryškus su visa trimate informacija. galima gauti. Šiuo metodu galima paprasčiausiai gauti informaciją apie paviršiaus formą, kurios negalima patvirtinti įprastais mikroskopais. Be to, paprastiems optiniams mikroskopams „raiškos gerinimas“ ir „fokusavimo gylio didinimas“ yra prieštaringos sąlygos, ypač esant dideliam padidinimui, tačiau konfokaliniams mikroskopams ši problema išspręsta.
2. Konfokalinės optinės sistemos privalumai
Konfokalinė optinė sistema apšviečia mėginio tašką, o atspindėtą šviesą taip pat priima taškiniai receptoriai. Kai mėginys dedamas į fokusavimo padėtį, beveik visa atspindėta šviesa gali pasiekti fotoreceptorių, tačiau mėginiui nukrypus nuo židinio, atspindėta šviesa negali pasiekti fotoreceptoriaus. Tai reiškia, kad konfokalinėje optinėje sistemoje bus išvedamas tik vaizdas, kuris sutampa su židiniu, o facula ir nenaudinga išsklaidyta šviesa bus ekranuoti.
3. Kodėl naudoti lazerį?
Konfokalinėje optinėje sistemoje mėginys yra apšviestas, o atspindėtą šviesą taip pat priima taškinis fotoreceptorius. Todėl taškinis šviesos šaltinis tampa būtinas. Lazeris priklauso labai taškiniam šviesos šaltiniui. Daugeliu atvejų konfokalinio mikroskopo šviesos šaltinis naudoja lazerio šviesos šaltinį. Be to, tokios lazerio savybės, kaip monochromatiškumas, kryptingumas ir puiki spindulio forma, taip pat yra svarbios plačios jo naudojimo priežastys.
4. Įmanomas stebėjimas realiuoju laiku, pagrįstas didelės spartos nuskaitymu.
Atliekant skenavimą lazeriu, akustinis optinis deflektorius (AO pagrindinis elementas) naudojamas horizontalia kryptimi, o servo Galvano veidrodis – vertikalia kryptimi. Kadangi akustinio optinio nukreipimo bloke nėra mechaninės vibracijos dalies, jis gali skenuoti dideliu greičiu, o stebėjimo ekrane galima stebėti realiu laiku. Didelis šios kameros greitis yra labai svarbus projektas, kuris tiesiogiai veikia fokusavimo ir padėties nustatymo greitį.
5. Ryšys tarp židinio padėties ir ryškumo
Konfokalinėje optinėje sistemoje pavyzdį teisingai padėjus į fokusavimo padėtį, šviesumas yra didelis, o prieš ir po jo ryškiai sumažės (ištisinė linija 4 pav.). Šis jautrus židinio plokštumos selektyvumas taip pat yra konfokalinio mikroskopo aukščio krypties matavimo ir židinio gylio išplėtimo principas. Priešingai, įprastas optinis mikroskopas neturi akivaizdaus ryškumo pokyčio prieš ir po fokusavimo padėties (punktyrinė linija 4 paveiksle).
6. Didelis kontrastas ir didelė raiška
Bendrajame optiniame mikroskope nuo židinio nukrypusi atspindėta šviesa trukdys ir persidengs su fokusavimo vaizdavimo dalimi, taip sumažindama vaizdo kontrastą. Priešingai, konfokalinėje optinėje sistemoje išsklaidyta šviesa už židinio ribų ir išsklaidyta šviesa objektyvo lęšio viduje beveik visiškai pašalinama, todėl galima gauti labai didelio kontrasto vaizdą. Be to, kadangi šviesa pro objektyvo lęšį praeina du kartus, pirmiausia paryškinamas taškinis vaizdas, pagerėja ir mikroskopo raiška.
7. Optinės lokalizacijos funkcija
Konfokalinėje optinėje sistemoje kitos dalies, išskyrus židinio tašką, atspindėta šviesa yra ekranuota mikroporomis. Todėl stebint trimatį pavyzdį susidaro toks vaizdas, koks susidaro sufokusavus mėginį (5 pav.). Šis efektas vadinamas optine lokalizacija, kuri priklauso vienai iš konfokalinės optinės sistemos krypčių.
8. Fokusavimo judančios atminties funkcija
Vadinamoji atspindėta šviesa už židinio ribų yra apsaugota mikroporomis. Kita vertus, galima manyti, kad visi konfokalinės optinės sistemos suformuoti vaizdo taškai sutampa su židiniu. Todėl, jei trimatis mėginys bus perkeltas Z ašies (optinės ašies) kryptimi, vaizdas bus kaupiamas ir saugomas atmintyje, o zui galiausiai gaus vaizdą, susidarantį sutapus visam mėginiui ir fokusavimui. . Tokiu būdu begalinio fokusavimo gylio funkcija vadinama mobiliosios atminties funkcija.
9. Paviršiaus formos matavimo funkcija
Naudojant židinio perkėlimo funkciją, mėginio paviršiaus formą galima išmatuoti nekontaktiniu būdu, pridedant aukščio įrašymo kilpą. Remiantis šia funkcija, kiekviename pikselyje galima įrašyti Z ašies koordinates, kurias sudaro didelė zui ryškumo reikšmė, ir remiantis šia informacija galima gauti informaciją, susijusią su mėginio paviršiaus forma.
10. Didelio tikslumo mikro dydžio matavimo funkcija
Šviesos priėmimo blokas turi vienmatį CCD vaizdo jutiklį, todėl nuskaitymo įrenginio nuskaitymo pakreipimas jam negali turėti įtakos, kad būtų galima atlikti didelio tikslumo matavimus. Be to, kadangi tuo pačiu metu naudojama fokusavimo atminties funkcija su reguliuojamu židinio gyliu, matavimo paklaida, kurią sukelia fokusavimo poslinkis, gali būti pašalinta.
11. Trimačio vaizdo analizė
Naudojant paviršiaus formos matavimo funkciją, galima lengvai padaryti trimatį mėginio paviršiaus vaizdą. Galima atlikti ne tik tai, bet ir daugybę analizių, tokių kaip: paviršiaus šiurkštumo matavimas, plotas, tūris, paviršiaus plotas, apskritimas, spindulys, zui ilgis, perimetras, svorio centras, tomografinis vaizdas, FFT transformacija, linija pločio matavimas ir pan.
Lazerinis konfokalinis skenuojantis mikroskopas gali būti naudojamas ne tik ląstelių morfologijai stebėti, bet ir kiekybinei ląstelių biocheminių komponentų analizei, optinio tankio statistikai bei ląstelių morfologijos matavimui.
